CD69在細胞活化、凋亡中的雙向免疫調節作用*

吳丹丹， 汪慧英

(浙江大學醫學院附屬第二醫院1感染性疾病科，2變態反應科，杭州 浙江 310009)

分化抗原簇 69(cluster of differentiation 69，CD69)于1981年發現，早期被稱為活化誘導分子(activation inducer molecule，AIM)，早期活化抗原－1(early activation antigen－l，EA －1)等，是 C － 型凝集素受體家族的成員，CD69基因屬于自然殺傷細胞(natural killer cell，NK細胞)信號轉導基因復合體家族，在細胞的生物功能調節中起著重要的信號轉導作用。初始的研究證實CD69在細胞的活化中起著重要的促進作用。近年來的研究顯示，CD69的表達在促進細胞進一步活化的同時，還可能與細胞的凋亡密切相關［1］。本文就CD69在細胞活化和凋亡過程中的這一雙向免疫調節作用進行綜述。

1 CD69的分子結構和基因定位

對CD69的分子結構研究顯示:CD69是一種Ⅱ型跨膜糖蛋白，由199個氨基酸組成，包括40個殘基的細胞內區，21個殘基的跨膜區和138個殘基的細胞外區。細胞外區有特征性的Ca2+依耐性糖基識別區域。CD69通常以同源二聚體形式存在，由分子量為28 kD和32 kD的2條鏈經二硫鍵連接，這2條鏈由分子量為22.5 kD的多肽鏈通過不同的糖基化組成。每條鏈細胞外區有1個位于第166個氨基酸位置的N端連接的糖基化位點，提示糖基化鏈的遺傳異質性，但此遺傳異質性的結構和功能的重要意義尚不清楚。CD69在細胞表面表達均為磷酸化形式［2］，這對它與其它細胞表面的蛋白分子連接很重要。CD69在細胞的生物功能中起著重要的信號轉導作用。

小鼠與人的CD69有58%的同源性，也是由199個氨基酸組成的蛋白質。不同的是鼠的CD69有3個N端連接的糖基化位點，其中的一個與人的高度同源。CD69基因屬于NK細胞信號轉導基因復合體家族，人的CD69基因與NKG2基因叢相近，而后者在NK細胞的信號轉導和靶向識別中有重要作用。不同的是，自然殺細胞受體蛋白1(natural killer cell receptor protein 1，NKP－P1)、NK細胞的抑制性受體Ly49與NK細胞活化性受體NKG2分子只表達在NK細胞上，而CD69可在多種細胞上表達。說明CD69有不同于這三者的特性。人的CD69基因位于12號染色體的短臂12p12.3－p13.2區，鼠的CD69基因位于6號染色體長臂的遠端。小鼠的CD69基因結構已經確定，該基因由5個跨越7.5 kb的外顯子組成，第1、2外顯子分別編碼細胞漿和跨膜區，第3－5外顯子編碼CRD。

2 CD69在細胞活化中的作用

CD69自被發現后，其初始研究基本上是關于它在細胞活化中的作用。CD69可在幾乎所有髓系細胞中表達。但除了在血小板和單核細胞中有持續的低水平表達外，CD69在其它細胞靜止狀態下并不表達，而是在細胞激活后表達。早期的研究主要集中于它在 T細胞和 NK細胞中的表達［3，4］。靜止的 T細胞或NK細胞一般不表達CD69，通過T細胞受體(T cell receptor，TCR)接受CD3/TCR復合物、植物血凝素(phytohemagglutinin，PHA)、蛋白激酶 C(protein kinase C，PKC)激活物佛波醇乙酯(phorbol myristate acetate，PMA)等刺激信號，1 h后細胞表面即有CD69的表達，此后CD69的表達迅速達到高峰，并可持續至72 h。但不同的刺激物誘導CD69表達的峰值時間有所不同。隨后的研究發現，B細胞在PMA、抗IgM或金黃色葡萄球菌Cowan I(SAC)的刺激下也可表達CD69。中性粒細胞亦可在PAM刺激后表達CD69。對于CD69在嗜酸性粒細胞(eosinophils，Eos)表面的表達研究較少，直至1995年研究者利用國際第五工作室提供的473種人類白細胞抗體對人Eos表面抗原進行研究，發現靜止的外周血Eos表面并不表達CD69，而體外粒細胞－巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte－macrophage colonystimulating factor，GM －CSF)、白細胞介素 －5(interleukin－5，IL－5)培養后的Eos及哮喘患者支氣管肺泡灌洗液(bronchial alveolar lavage fluid，BALF)中Eos均有CD69的表達［5］。其它實驗顯示體外細胞因子可誘導外周血 Eos表達 CD69，其中 IL－4、IL－13與腫瘤壞死因子－γ(tumor necrosis factor－γ，TNF－γ)有協同作用［6］。研究亦顯示小鼠Eos佛波醇乙酯PMA等作用下1 h即有CD69的表達，在18 h 到高峰［7］。Yamamoto 等［8］進一步研究其表達機制，利用培養的單層人肺微血管內皮細胞，以IL－1β刺激其表達細胞間黏附分子(intercellular adhesion molecule－1，ICAM－1)，哮喘患者外周血Eos通過該上皮層后有CD69、人白細胞DR抗原［human leukocyte antigen(locus)DR，HLA －DR］、ICAM －1表達顯著增加及存活率顯著增高。CD69的這種僅在不同細胞活化后表達的特性，使得它在許多研究中被作為細胞活化的標記分子。

CD69在以上這些細胞中的表達均為早期活化階段。早期CD69的快速表達可能依賴于細胞內存儲的CD69蛋白，而此后的持續表達則需要RNA的轉錄和蛋白質的合成。誘導CD69表達的機制主要是PKC的激活和細胞內Ca2+水平的持續增高［9］，阻斷PKC通路可直接抑制CD69的表達［10］。后兩者可作用于Ras蛋白，Ras蛋白與三磷酸鳥苷(guanosine triphosphate，GTP)連接，是一個重要的細胞內信號分子，而最近的研究顯示Ras－GTP偶合蛋白不僅可促進活化信號Akt，MEK(絲裂原活化蛋白激酶/細胞外信號調節激酶激酶，MAPK/ERK激酶)，細胞外信號調節激酶(extracellular signal－regulated kinase，ERK)磷酸化，是CD69表達所必需的條件［11］。

CD69在活化細胞中的快速表達并不僅僅作為一個標記分子，事實上，它更重要的作用是作為細胞共刺激信號進一步增強細胞的活化或增殖分化。首先，CD69的表達可介導細胞激活后細胞因子的合成，如CD69+T細胞可有 IL－12β、IL－18α 和IL－16β mRNA水平增高，并在重組IL－12或IL－18的作用下有干擾素 － γ(interferon－ γ，IFN － γ)的產生［12］;由于缺乏明確的體內CD69配體，抗CD69mAb常用于分析CD69的作用。在刺激物如PMA的存在下，抗CD69 mAb可刺激T細胞分泌IL－2，進一步加快增殖，誘導單核細胞釋放一氧化氮(nitric oxide，NO)，血小板細胞脫顆粒激活花生四烯酸代謝。抗CD69mAb可影響由IL－2激活的NK細胞對靶細胞的裂解作用。Eos表面CD69的表達與GM－CSF的自分泌密切相關。Dallaire等［13］亦發現Eos通過單層內皮細胞后即有CD69表達，并伴白三烯C4的釋放增加。

CD69的這種細胞活化作用的機制并不明確。雖然CD69分子的胞內區非常短，且未有可識別的功能相關殘基，尚未明確與其胞內分子相連的信號蛋白。但近來的研究顯示CD69在NK細胞中可能激活Src通路中的Syk蛋白［14］。也有報道稱CD69在細胞內信號轉導通路中可通過偶合G蛋白來起作用。其確切機制這有待探討。

3 CD69在細胞凋亡中的作用

雖然CD69在細胞活化中的有著重要作用，但近年來的研究顯示，CD69的表達在體內與細胞的凋亡密切相關。在體內活化的具有CD69高表達的T細胞在體外易于快速自發凋亡［15］，CD69－/－小鼠腹腔和脾中淋巴細胞存活率增高，凋亡明顯減少，脾淋巴細胞在激活后的凋亡明顯低于野生型小鼠，并有凋亡信號caspase－3的活化減少［16］。研究發現PMA刺激后CD69高表達的Eos亦有凋亡的顯著增加;國外有人在Eos體外培養時，加入antiCD69mAb可增加細胞凋亡，伴有抗凋亡信號B細胞淋巴瘤/白血病－2(B －cell leukemia－lymphoma，bcl－2)表達下降的報道［17］，且CD69與抗體的交聯所誘導的Eos凋亡并不受周圍環境中GM－CSF的影響［18］。

與死亡受體CD95相比，CD69介導的凋亡有其自己的特點［17］，CD95介導的凋亡幾乎涉及所有細胞類型，而明確可由CD69介導的凋亡細胞主要為活化的嗜酸性粒細胞和單核細胞。另外，CD95在靜止細胞及活化細胞上均可表達，因此CD95誘導的凋亡與細胞活化狀態無關;而CD69在大多數靜止、非活化的髓系細胞中無表達，僅在血小板和單核細胞中有結構性表達。CD69誘導的凋亡可選擇性作用于被活化后的細胞，而對于非活化細胞則無此作用。以嗜酸性粒細胞為例，CD69在許多變態反應性疾病中，可作為嗜酸性粒細胞凋亡的一個理想死亡受體，它可誘導變態反應炎癥部位聚集的活化嗜酸性細胞凋亡，從而改善局部炎癥，但對于外周血中未活化的嗜酸性粒細胞則無此影響。因此，與CD95相比，以CD69作為誘導凋亡的靶目標副反應更小。另一方面，根據細胞種類的不同，CD69的作用具有多面性，如增加IgM抗體刺激后的B細胞增殖，增加單核細胞NO生成，活化單核細胞和NK細胞的細胞毒作用。目前尚未有抗CD69單抗對其它表達CD69的細胞(如T或B淋巴細胞)誘導凋亡的報道，但很可能是其誘導凋亡的路徑尚未發現。

關于CD69介導細胞凋亡的分子機制仍不明確。研究顯示CD69介導的單核細胞凋亡與3個不同的信號通路相關［19］:(1)依賴于NO;(2)與磷脂酶A2/磷脂氧化酶級聯反應相關;(3)受百日咳毒素(PTX)敏感的G蛋白影響，且三者都是誘導單核吞噬細胞凋亡的必要不充分條件。此外，TGF－β可能在其中起一定的作用［16］。以膠原誘發的關節炎(collagen induced arthritis，CIA)為例［20］，CD69 缺陷鼠可因 T細胞和B細胞對膠原過度反應而導致CIA的急性發作，而此急性發作與炎癥關節中TGF－β水平的降低相關。而抗TGF－β抗體在野生型小鼠中可加重CIA的嚴重程度，使得炎癥細胞因子和炎癥介質的分泌增加，但對CD69缺陷小鼠卻無此作用。在NK細胞敏感的腫瘤模型中，CD69缺陷鼠中免疫細胞分泌TGF－β明顯減少并導致淋巴細胞凋亡減少，從而增強了抗腫瘤的能力［21］。以上這些研究提示CD69可能通過介導TGF－β的合成來調節細胞的凋亡。

此外，CD69的分子結構、表達機制本身也存在其誘導凋亡作用的分子基礎。CD69可與凋亡信號分子鈣網織蛋白(calreticulin)的N末端相連接也提示CD69可能在細胞凋亡中起著重要的信號轉導作用［2］;CD69的表達依賴PKC的激活和細胞內Ca2+水平的持續升高，而PKC激活、胞漿內Ca2+濃度升高都與細胞凋亡信號轉導密切聯系。此外，CD69高表達的T細胞可測到Fas的表達增加［22］，后者也是細胞凋亡的重要信號轉導分子。另外，antiCD69mAb可下調抗凋亡基因bcl－2的表達，同樣是促進細胞凋亡的一個重要機制。

綜上所述，CD69不僅在細胞的活化中起著重要的促進作用，它與細胞活化后的凋亡也有著密切聯系。

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