α－突觸核蛋白的生物學功能及其在帕金森病中的作用*

熊中奎， 胡雅兒

(1紹興文理學院醫學院臨床醫學部，浙江 紹興 223000;2上海交通大學醫學院細胞調控實驗室，上海 200025)

α－突觸核蛋白(α－synuclein)是一種腦內含量豐富的神經蛋白，既參與正常突觸功能的維持，又與各種神經退行性疾病有關。在帕金森病(Parkinson’s disease，PD)患者腦內，α－突觸核蛋白是多巴胺神經元中嗜伊紅染色Lewy小體主要成分。α－突觸核蛋白基因位于染色體4q21.3－q22，均由5個外顯子構成。α－突觸核蛋白由140個氨基酸殘基構成，分子量約19 kD。根據估算，α－突觸核蛋白占腦勻漿蛋白含量的1%，在端腦中含量豐富。最初研究認為α－突觸核蛋白與核膜之間存在關聯性，而后來的研究發現它可通過經典分泌通路被分布于各種質膜上。α－突觸核蛋白分子在自然狀態下呈伸展狀，其保守的賴氨酸和谷氨酸殘基與兩性端部基團(headgroup)相互作用，而中性基團插入到酰基鏈區域，使之在質膜上呈疏松的卷曲α－螺旋結構，伸展并平行于質膜的曲面［1］。

1 生物學功能

到目前為止，還沒有全面地認識α－突觸核蛋白的生物學功能，但是現有資料至少表明α－突觸核蛋白具有以下幾種功能:(1)調節突觸的可塑性。Golovko等［2］研究發現α－突觸核蛋白在斑胸草雀(zebra finch)學習唱歌的階段表達上調，而且主要定位于突觸前神經末梢，故推測在突觸可塑性和功能方面發揮重要作用。在體外培養胚胎大鼠海馬神經元中，突觸蛋白I(synapsin I)在體外培養的第1 d即可檢測到表達，而α－突觸核蛋白直至培養約5 d時仍然未檢測到，因此認為它可能與突觸的后期發育及調節有關。(2)整合突觸前信號。通過其脂質結合特性和增強磷脂酶D的活性促進突觸囊泡的形成，α－突觸核蛋白調節突觸前神經末梢跨膜轉運。(3)調節突觸處的多巴胺含量。α－突觸核蛋白抑制兒茶酚胺合成限速酶酪－氨酸羥化酶活性。在突觸末端囊泡單胺轉運體－2迅速而有效地轉運多巴胺，α－突觸核蛋白調節多巴胺轉運體在細胞膜上穿梭影響多巴胺在神經末梢攝取的效率。⑷調節小膠質細胞活性。α－突觸核蛋白敲除小膠質細胞再受到刺激后，與對照組比較，前炎癥因子腫瘤壞死因子－α和白細胞介素－6的分泌水平提高。⑸熱休克蛋白樣作用。α－突觸核蛋白的C－端區域與小熱休克蛋白如α－晶體蛋白相似，能夠保護細胞內的蛋白免于變性。α－突觸核蛋白保護細胞免于溫度和氧化應激的影響，其C－端刪除導致它對細胞內蛋白對抗溫度應激的保護作用減弱。研究發現α－突觸核蛋白的缺失導致Parkin基因敲除所產生的損傷效應惡化;另一方面，恢復正常的α－突觸核蛋白水平可緩解Parkin丟失所致的神經毒性。⑹參與脂代謝調節。α－突觸核蛋白敲除小鼠的脂肪酸攝取、轉移、代謝過程被干擾，推測其參與細胞內脂肪酸的代謝，而且α－突觸核蛋白影響星形膠質細胞中脂肪酸的攝取和轉運。

2 α－突觸核蛋白與帕金森病

早在1996年意大利的PD家系中首先發現了α－突觸核蛋白點突變A53T，以后又發現了A30P和E46K。點突變增加其聚合度，二倍體和三倍體提高表達水平。果蠅轉基因突變模型進一步證實了α－突觸核蛋白基因突變與PD的關系，α－突觸核蛋白基因突變型果蠅成年后出現多巴胺能神經元減少，形成含α－突觸核蛋白的包涵體并表現出運動功能障礙。然而與點突變比較，α－突觸核蛋白基因重排在常染色體顯性遺傳性PD中出現的頻率更高［3］。在散發型PD的研究中未發現基因突變，α－突觸核蛋白基因多態性，如啟動子區，特別是Rep1多態性重復序列等位基因以及3’－末端多態性與散發性PD的壽命期有關。

2.1 影響病理性α－突觸核蛋白構型水平的因素研究發現α－突觸核蛋白的多種結構形式如無定型聚集物、寡聚體、原纖維和纖維及其磷酸化、硝基化和泛素化均有神經毒性。其中，α－突觸核蛋白纖維由5個β－折疊構成，每個原纖維2 nm×3.5 nm，β1→β5兩兩之間一次發生相互作用［4］。α－突觸核蛋白正常、錯誤折疊及其寡聚化之間存在動態平衡，當這種平衡被打破后原纖維迅速聚集成大分子、不溶性細纖維進而形成Lewy小體，以避免神經元受到更大的損害。然而這種保護作用是短暫的，α－突觸核蛋白的病理性積聚最終導致細胞的凋亡或死亡。

①基因突變。在一項離體實驗中，將野生型、A53T和A30P突變型人α－突觸核蛋白基因導入細菌。野生型和突變型α－突觸核蛋白在體外培養時都可以形成具有反向平行β－折疊的不溶性原纖維，其中突變型尤其是A53T突變型顯著加快纖維蛋白聚集物的形成。

②分子伴侶功能異常。分子伴侶的作用是保證蛋白質的正確折疊與組裝。目前發現的大多數分子伴侶都屬于熱休克蛋白(heat shock proteins，HSPs)家族，如HSP70、HSP40等。在HSP70和α－突觸核蛋白的轉基因果蠅模型中發現雖然對α－突觸核蛋白的包涵體模型無影響，但可明顯緩解多巴胺神經元的丟失，而在細胞模型中HSP70的高表達可減少α－突觸核蛋白聚集物的形成。

③泛素蛋白酶體系統的缺陷。體內大多數錯誤折疊、未裝配以及損傷的蛋白質的是在泛素標記并被特異性識別后，由泛素蛋白酶體系統降解清除。在PD家族中發現泛素羧基端水解酶基因突變造成酶活性下降，出現典型的PD癥狀。當α－突觸核蛋白原纖維的濃度超過26S蛋白酶體的5倍，則可顯著抑制無定形蛋白的非泛素依賴蛋白酶體降解和折疊蛋白的泛素依賴降解。α－突觸核蛋白是蛋白酶體的底物，抑制蛋白酶體的活性則進一步引起α－突觸核蛋白的積累和聚集，最終形成一個惡性循環［5］。④翻譯后修飾。1)磷酸化修飾。α－突觸核蛋白第129位絲氨酸磷酸化 (pS129)是PD的一個重要特征［6］。體外實驗發現pS129后比未磷酸化者能夠產生更多寡聚體和不溶性成分。該磷酸化主要由polo樣激酶－2(polo－like kinase－2，PLK2)和PLK3完成的，磷酸化率大于95%，底物識別是通過N－末端重復序列和(或)NAC區［25］。第一、在哺乳動物細胞系、原代神經元和α－突觸核蛋白轉基因小鼠的各種亞細胞部分，如細胞質、細胞核和細胞膜中均發現PLKs特異性與pS129共存。第二、PLK2在阿爾采末病患者和Lewy體患者表達水平顯著增加。氧化應激和蛋白酶體抑制引起pS129水平增加［7］。而α－突觸核蛋白第125位絲氨酸磷酸化可抑制其寡聚體的形成［8］。2)泛素化修飾。在多巴胺神經元中泛素－蛋白異構肽連接酶(ubiquitin－protein isopeptide ligase)seven in absentia homolog(SIAH)催化 α －突觸核蛋白的單泛素化修飾促進其聚集［9］。SIAH催化α－突觸核蛋白單泛素化位點有第10、12、21、23、34、43和96位絲氨酸殘基。電鏡下觀察到單泛素化α－突觸核蛋白大量非晶體狀聚集，在體內單泛素化增加α－突觸核蛋白包涵體的形成。synphilin－1A抑制SIAH來調控α－突觸核蛋白的單泛素化及包涵體的形成［10］。3)硝基化和氧化修飾。硝基化和氧化α－突觸核蛋白在包涵體中被檢測到。胞質DA尤其是其氧化代謝產物，與α－突觸核蛋白發生相互作用，使α－突觸核蛋白形成錯誤折疊構型，如α－突觸核蛋白蛋氨酸殘基氧化產生二硫鍵導致可溶性寡聚體形成［11］。在PD患者的包涵體內發現大量硝基化α－突觸核蛋白。氧化應激狀態下，α－突觸核蛋白第125位酪氨酸殘基是硝基化的特異性靶點。硝基化破壞了α－突觸核蛋白正常構象，引起蛋白質異常集聚。實驗研究發現小膠質細胞激活釋放的一氧化氮和過氧化物是PD病變中異常的硝基化和氧化α－突觸核蛋白產生的原因［12］。

2.2 病理性α－突觸核蛋白在PD發病機制中的作用

①干擾脂質雙分子層并使之通透性增加，影響突觸囊泡完整性以及胞質DA水平。突變型(A30P或A53T)α－突觸核蛋白均可干擾囊泡pH，顯著增加胞質中兒茶酚胺，使胞內氧化還原損傷趨于惡化。研究發現A30P、A53T突變以及變異型原纖維α－突觸核蛋白都比野生型對突觸囊泡通透性具有更強的影響。原纖維α－突觸核蛋白誘導的通透性表現出囊泡中低分子量物質優先漏出的特點，這表明可能是一種微孔樣通透機制。當囊泡膜穩定性較差如Ca2+缺乏時，這種通透性對漏出的物質更加缺乏分子量上的選擇性，而且單分子態α－突觸核蛋白即可通過洗滌劑樣作用機制誘導囊泡膜的通透性增強。Danzer等［13］發現某些寡聚體誘導細胞死亡通過微孔形成機制破壞胞內離子平衡，如誘導鈣內流，還有部分寡聚體通過直接進入胞內引起α－突觸核蛋白積聚增加。Guo等［14］證實上調α－突觸核蛋白表達可抑制VMAT－2的活力，進一步干擾DA的代謝并導致DA神經元的損傷。

②影響胞內物質運輸功能。第一，影響內質網→高爾基體的囊泡運輸。表達α－突觸核蛋白的酵母菌中出現最早的缺陷是從內質網到高爾基體囊泡運輸被阻斷。過表達α－突觸核蛋白抑制內質網→高爾基體囊泡運輸，囊泡以出芽方式順利從內質網出來，但是隨后在特定部位停留并與高爾基體膜融合時被抑制，定位于高爾基體后囊泡的RAB8A和定位于神經末梢的RAB3A緩解過表達α－突觸核蛋白所致的神經毒性［15］。第二，影響軸漿運輸。研究發現將α－突觸核蛋白的A30P或A53T點突變基因轉染到體外培養神經元上，神經元表現出軸漿運輸減弱，而且發現轉染A30P的神經元α－突觸核蛋白易于集聚到胞體。而軸漿運輸的減弱可能促進了α－突觸核蛋白的核周集聚、Lewy小體形成和神經元的異常改變。Chung等［16］發現在AAV－α－突觸核蛋白大鼠病理模型紋狀體和黑質中，發生神經元丟失之前突觸傳遞和軸漿運輸相關蛋白發生明顯變化。紋狀體rabphilin 3A和syntaxin減少。紋狀體內順向運輸動力蛋白(KIF1A、KIF1B、KIF2A、KIF3A)降低，而逆向運輸動力蛋白(dynein、dynamitin、dynactin 1)增加。黑質內HIF1和AHIF2A增加。細胞骨架蛋白發生急劇改變，actin水平增加而α－微管蛋白和γ－微管蛋白水平降低。

③導致蛋白酶體降解抵抗。過表達血紅素加氧酶－1(heme oxygenase－1，HO－1)可劑量依賴性減少神經母細胞瘤M17細胞中α－突觸核蛋白水平并減少其聚集，而不能顯著影響A30P突變型α－突觸核蛋白。當神經元暴露于誘導蛋白錯誤折疊的有害刺激下，HO－1觸發蛋白酶體降解通路，防止胞內蛋白聚集及包涵體形成;然而A30P突變型α－突觸核蛋白PD患者表現出對HO－1誘導蛋白酶體降解的抵抗［17］。

④影響吞噬功能。有研究發現，表達A53T點突變，甚至某些情況下野生型α－突觸核蛋白的神經元表現出分子伴侶介導自體吞噬(chaperone mediated autophagy，CMA)功能障礙，后者引起代償性巨型自體吞噬(macroautophagy)，而巨型自體吞噬作為一種損害性反應導致神經元的死亡［18］。

⑤神經炎癥反應。硝基化α－突觸核蛋白通過CD4+細胞亞群誘導小膠質細胞炎癥反應［19］。Chung等［16］發現在AAV－α－突觸核蛋白大鼠病理模型紋狀體和黑質中，出現神經炎癥反應，Iba－1激活小膠質細胞和前炎癥細胞因子IL－1β、IFN－γ和TNF－α水平增加。

⑥影響組蛋白乙酰化。體外實驗中A30P和A53T突變增加α－突觸核蛋白進入細胞核的比例。進入細胞核的α－突觸核蛋白產生毒性，而保留在細胞質中的α－突觸核蛋白具有保護作用。α－突觸核蛋白的毒性通過給予組蛋白去乙酰化酶抑制劑解除。α－突觸核蛋白直接結合到組蛋白上，降低乙酰化組蛋白H3水平并抑制乙酰化作用。

⑦tau蛋白過度磷酸化。研究發現12個月齡A53T突變型轉基因小鼠的突觸部位發現tau蛋白第396位絲氨酸異常磷酸化，α－突觸核蛋白激活糖原合成酶激酶 －3β(glycogen synthase kinase－3β，GSK －3β)，后者催化 tau 蛋白的過度磷酸化［20］。

事實上，許多具有重要生理功能的蛋白質在特定條件下也會表現出毒性作用。一般認為超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)對氧化應激具有保護作用，然而SOD的過度表達也可產生神經損傷，這一點體現在肌萎縮脊髓側索硬化癥上。迄今α－突觸核蛋白的功能還未完全了解，但是很多證據表明正常α－突觸核蛋白在細胞內具有多種重要生物學功能，而過度表達、異常修飾或者突變α－突觸核蛋白會對細胞產生顯著病理性損傷作用［21］。

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