結核桿菌潛伏感染小鼠模型的制備及其評價指標

師長宏

(第四軍醫大學實驗動物中心，西安 710032)

結核桿菌潛伏感染小鼠模型的制備及其評價指標

師長宏

(第四軍醫大學實驗動物中心，西安 710032)

目前對于結核分枝桿菌進入潛伏期的機制以及再激化的原因知之甚少，一個重要的原因是缺乏潛伏感染(LTBI)動物模型，完整的LTBI模型應包括兩種類型，一是低劑量荷菌的持續性感染模型，另一種為潛伏感染模型，即Cornell模型的改進型。綜合使用柯氏量表評分、脾肺荷菌數、誘導的 IFN-γ和 TNF-α水平、組織中 IL-10和 IL-4的表達、臟器中特異性抗原負荷以及激素誘導 TB復發的時間、潛伏感染相關基因的表達水平等指標可以比較準確、客觀、特異性的評價小鼠LTBI模型的反應性。

潛伏感染;模型;評價

WHO公布的數據顯示，全球約有1/3人口處于結核分枝桿菌(M.tuberculosis，MTB)感染狀態，其中5% ～10%的感染者有可能發展為活動性結核［1］(tuberculosis，TB)，而 90%以潛伏感染(latent tuberculosis infection，LTBI)形式存在，形成無臨床癥狀的隱性感染者［2］。LTBI不同于急性感染，病因復雜，病程長，目前對于MTB進入潛伏期的機制以及再激化的原因知之甚少，一個重要的原因是缺乏標準化的LTBI動物模型，對模型的反應性缺乏準確、客觀、靈敏的評價指標。本文就LTBI小鼠模型的制備方法及特異性評價體系的建立進行了綜述。

1 小鼠LTBI模型

MTB感染機體后，一方面通過誘導T細胞產生Th1型細胞因子(如 IFN-γ)，活化巨噬細胞，增強其殺滅MTB的能力，從而起到保護性免疫作用。另一方面，Th2型細胞因子可通過抑制Th1型細胞因子，降低巨噬細胞殺滅MTB的能力，從而削弱MTB的免疫應答［3］。這種 Th1型/Th2型細胞因子的動態平衡可有效控制MTB的感染，但平衡一旦被打破，將會導致TB的發生與發展。其中，Th2型細胞因子與MTB的感染程度密切相關，在活動性肺結核模型中，Th2型細胞因子特別是 IL-4的產生隨著病程的進展和加重不斷增加，但治愈后Th2型細胞因子水平降低［4］。在 LTBI模型中，腎上腺皮質激素可用于誘導TB的復發，其主要原因就是誘導了Th2型的免疫反應，因此一個良好的MTB動物模型應體現出隨著病程的發展向Th2型反應的轉化，小鼠就可以較好的反應機體這種免疫應答模式的變化，但不同品系的小鼠對MTB感染的反應存在明顯差異。研究發現，低劑量(200 CFU)的MTB感染C57BL/6J小鼠，就可以引起急性病變［5］，這主要是誘發了強烈的Th1型細胞免疫反應，加重了肺的實變，最終還沒有轉換到 Th2型細胞因子的表達［6］，動物就死亡，而傳統使用的BALB/c小鼠用于LTBI研究也存在一些問題，主要是BALB/c小鼠的TB模型過于偏向Th2型的免疫應答，往往呈現出嚴重的結核病變，不能準確觀察到持續性感染的狀態［7］。當嘗試使用C57BL/6J×DBA/2F1代雜交鼠制備 LTBI模型，可有效克服單個近交品系復制LTBI模型的缺點［8］。

結合TB的臨床特征，小鼠LTBI模型應包括兩種類型，一是低劑量荷菌的持續性感染模型，存在少量的肉芽腫，小的肺泡炎癥，模型鼠體重持續增加，肺臟中有穩定的CFU，但無臨床癥狀，無自發性疾病復發。模型復制時采用103CFU的 H37RV，氣管內感染C57BL/6J×DBA/2F1代小鼠，3月后便可獲得穩定的慢性持續性感染模型［8］。另一種為潛伏感染模型，即 Cornell模型的改進型，用 104CFU H37Rv毒株經尾靜脈感染 C57BL/6小鼠。4周后用抗結核藥物 INH(85 μg/L)和 RIF(50 μg/L)加入飲水中持續治療 l2周，即為典型的潛伏感染模型，小鼠無臨床癥狀，脾肺無荷菌數，停藥4～6周后使用120 μg的地塞米松肌內注射，隔天1次，持續14 d便可誘導TB復發［9］。這兩種模型聯合起來完整再現了臨床TB患者持續性感染的兩種狀態，可用于LTBI發病機理和治療性藥物的研究。

2 評價LTBI小鼠模型反應性指標

用于評價LTBI模型反應性最簡捷、最經典的指標為脾、肺荷菌數以及臟器的病理學改變［10］。對于潛伏感染模型中無法獲得的臟器荷菌數可選擇地塞米松誘導TB復發的時間，以及復發后的臟器荷菌數，但這些指標的特異性和準確性有限。MTB作為一種局限性感染，結核的控制主要取決于感染機體免疫系統多種細胞成分的配合和多種前炎和抗炎細胞因子的協調作用。對MTB感染的應答反應，一般需要多種細胞因子來調節細胞介導的組織損傷，同時，還需要對多種細胞因子的調節以有效清除病原體［11］。這樣作用的結果往往體現出一種綜合效應，可能使組織的荷菌數減少了，但誘導的免疫反應卻加重了組織的病理損傷，因此必須綜合運用多種指標評價LTBI小鼠模型的反應性，具體包括:

2.1 動物的大體觀察

包括動物的體重，飲食狀況、被毛色澤，活動能力和行為學變化。結合臨床患者柯氏量表Karnofsky performance status［12］，我們實驗室制訂了符合小鼠MTB模型的柯氏量值以供參考。整體小鼠反應分6級，0級體征為毛色光滑，受輕度激惹活動正常，反應迅速，維持正常頻繁的穿梭移動及嗅探活動，眼睛有光澤，巴氏分數為90～100。1級體征為毛色略顯不順，受激惹反應變慢，無頻繁穿梭移動及嗅探活動，正常飲水進食不受影響，無昏睡，無共濟失調，巴氏分數為70～90。2級體征為毛色明顯不順，無光澤，出現豎毛，發干，眼睛無神，昏睡癥狀，活動明顯減少，對激惹反應明顯變慢，飲水進食受限體型顯瘦小，巴氏分數為50～70。3級體征為毛色灰暗、倒豎或出現明顯掉毛、結塊等，對激惹基本無反應，處于角落，籠內驅趕僅緩慢移動躲避，基本沒有額外活動，精神萎靡，眼睛發干，發紅，有明顯的昏睡癥狀，明顯的共濟失調，飲水進食明顯受限，體型明顯瘦小，巴氏分數為30～50。4級體征為毛色灰暗或出現斑禿，對外來刺激無反應，軀干彎曲，籠內驅趕無反應，體型瘦小，呼吸急促，巴氏分數為10～30。5級體征為瀕死狀態或死亡，巴氏分數為0～10。

2.2 PPD實驗

即結核菌素試驗。是基于Ⅳ型變態反應原理的一種皮膚試驗，可用來檢測機體對結核桿菌的反應性，若LTBI小鼠模型被誘導激活，開始呈現活動性反應，則局部表面皮膚出現紅腫硬節，隨著體內MTB數量的增加，硬結直徑變大;當體內結核桿菌處于潛伏感染狀態，則注射局部無變態反應發生［13］。

2.3 脾、肺荷菌數

取LTBI小鼠的肺、脾組織研磨后在7H10培養基培養4周以上，計數臟器荷菌數以確定動物的感染程度。對于潛伏感染模型中無法獲得的荷菌數，可選擇地塞米松誘導TB復發的時間，以及復發后的臟器荷菌數，作為模型復制成功的指標，也可用作LTBI疫苗和相關藥物治療效果的評價［10］。

2.4 免疫學指標

Th1 細胞以分泌 IL-2、IL-12、IFN-γ 和 TNF-α 為特征，主要參與細胞介導的免疫反應并在抵御MTB感染方面起著重要作用。在Th1型細胞因子活化巨噬細胞的過程中，IFN-γ和TNF-α起著關鍵的作用，他們能促進巨噬細胞的活化，誘導iNOS的表達［14］。在LTBI的小鼠肺中，肉芽腫和肺泡中有大量的Th1型細胞因子，高表達IFN-γ和TNF-α，而IL-4處于很低的水平，這種免疫狀態是誘導和維持潛伏感染的重要因素。已有實驗發現潛伏感染的小鼠在接受TNF-α中和抗體后能夠使 TB復發，說明 TNF-α在維持潛伏感染中起重要作用［15］。基于此，機體誘導的 IFN-γ和TNF-α水平、組織中 IL-10和 IL-4的表達水平可以綜合反映LTBI小鼠模型的反應性。

2.5 形態學指標

包括脾、肺組織的HE染色和抗酸染色，前者主要是觀察脾、肺的病理學變化，包括組織結構是否完整，淋巴細胞的浸潤，肉芽腫和單核巨噬細胞的形成等，后者觀察感染組織中的 MTB數量和形態，這些形態學指標主要用于評價LTBI感染誘發的組織結構損傷［16］。

2.6 抗原負荷

LTBI小鼠誘發的免疫反應可使機體內MTB相關抗原負荷發生改變。當活動性TB發展為潛伏感染時，分枝桿菌抗原和(或)細菌殘留減少，隨著抗原負荷進一步降低，肉芽腫性炎癥和纖維化的范圍的相應減少，提示有效清除感染部位的長期的抗原殘留對于肉芽腫損害消退是必須的。因此可通過免疫定位的方法測臟器中特異抗原負荷來確定LTBI小鼠的轉歸，激活和持續感染［17］。

2.7 潛伏感染相關基因的表達水平(hspX和icl)

MTB潛伏感染的存在主要是由于它具有逃避巨噬細胞吞噬和殺滅作用，細菌呈休眠狀態，這可能與MTB中一些基因的表達有關。目前，MTB潛伏感染的相關基因并不是很明確，研究發現體外長期處于乏氧和非增值狀態的結核毒株H37Rv細胞壁增厚，定位于細胞壁的編碼α晶狀體球蛋白的hspX基因高度表達，最多可達到整個菌體蛋白的25%，這是MTB休眠和應激時的一種表現，可能是MTB能以休眠狀態長期存在的主要原因［18］，因此可將hspX蛋白作為MTB休眠菌的標志物。除hspX外，異檸檬酸裂解酶(isocitrate lyase，ICL)是迄今發現與MTB潛伏感染較為相關的因子，它是 MTB在潛伏感染狀態下利用碳源的關鍵酶。MTB一般通過三羧酸循環代謝糖類生存，而處在休眠狀態時則主要通過乙醛酸循環途徑代謝脂肪酸維持生存。ICL為MTB乙醛酸代謝途徑的關鍵酶之一，催化異檸檬酸裂解為琥珀酸和乙醛酸。研究表明，當MTB處于潛伏狀態或被巨噬細胞吞噬后，其ICL的表達水平顯著升高［19］。因此在MTB急性感染和休眠菌轉化過程中，通過檢測組織中hspX和icl基因表達水平的變化可以間接判斷細菌的休眠菌狀況，判斷MTB潛伏感染的變化。

綜上所述，理想的小鼠LTBI模型應能夠充分模擬臨床TB患者持續性感染狀態;使用柯氏量表得分、脾肺荷菌數、誘導的 IFN-γ和 TNF-α水平、組織中IL-10和 IL-4的表達、臟器中特異性抗原負荷以及激素誘導TB復發的時間、潛伏感染相關基因的表達水平等相關指標可以比較準確、客觀、特異性的反映LTBI感染的發生發展和變化。

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Establishment of Latent Tuberculosis Infection Animal Model and Its Evaluation Indexes—A Review

SHI Chang-hong
(Laboratory Animal Centre，the Fourth Military Medical University，Xi'an 710032，China)

For lacking of latent tuberculosis infection(LTBI)animal models，researchers have little known about the mechanism of M.tuberculosis infection developing into latent phase and reactivating to disease.A sound mouse model for LTBI should contain two types:low-dose of persistent infection model and latent infection model，also known as the modified Cornell model.Many indexes can be used to exactly，objectively and specifically evaluate the reactivity of LTBI model，such as necropsy pathology scores，bacterial burden of spleen and lung，the induced levels of IFN-γ and TNF-α，expression levels of IL-10 and IL-4，burden of specific antigens in organs，time of TB reactivation after hormone injection，and the expression of latent-correlated genes.

LTBI;Mouse model;Evaluation;M.tuberculosis

Q95，Q891

A

1005-4847(2010)06-0538-04

10.3969/j.issn.1005-4847.2010.06.020

2010-08-02

國家“863”專項課題(2007AA02Z473);國家自然科學基金(NO.30972767);陜西省自然科學基金(SJ08C203)。

師長宏(1973－)，男，博士，副教授，研究方向:感染性疾病動物模型.E－mail:changhong@fmmu.edu.cn.