β-synuclein蛋白原核表達載體的構建與表達

陳安琪，劉學杰，崔曉棟，劉江月，張代娟，郭軍堂

(1.濰坊醫學院基礎醫學教學部，山東濰坊 261053;2.濰坊醫學院附屬醫院，山東濰坊 261041)

β-synuclein蛋白原核表達載體的構建與表達

陳安琪1，劉學杰2，崔曉棟1，劉江月1，張代娟1，郭軍堂1

(1.濰坊醫學院基礎醫學教學部，山東濰坊 261053;2.濰坊醫學院附屬醫院，山東濰坊 261041)

目的 構建人β-synuclein基因的原核表達載體，分析其在大腸桿菌中的表達。方法 從人腦組織中提取總RNA，用RT-PCR方法獲得人β-synuclein基因，克隆至pCUm-T載體中，PCR篩選陽性克隆并測序。將酶切后的目的片段克隆至原核表達載體pGEX-6P-1中，轉化大腸桿菌BL21。IPTG誘導后，經SDS-PAGE電泳分析目的蛋白的表達。結果 RT-PCR擴增出人β-synuclein基因，將其亞克隆至pGEX-6P-1構建成重組表達質粒，并在BL21中表達了β-synuclein蛋白。結論 成功構建人 β-synuclein的原核表達載體，并在大腸桿菌中表達了人 βsynuclein融合蛋白，為進一步研究β-synuclein在帕金森病中的作用奠定了良好的基礎。

β-synuclein;帕金森病;載體構建

β-synuclein蛋白由 l34個氨基酸組成，是synucleins蛋白家族成員之一。β-synuclein與 αsynuclein是同族異構體，兩者在結構上有78%的同源性，但缺失α-synuclein蛋白中部71－82位11個氨基酸長度的 NAC片段［1］。研究發現 β-synuclein能夠 抑 制 α-synuclein 聚 集［2］，明 顯 的 改 善 αsynuclein轉基因鼠出現的動力缺乏，有抑制細胞凋亡的作用［3］，對帕金森病(Parkinson's disease，PD)具有明顯的神經保護作用，但具體的機制尚不清楚。研究 β-synuclein與其他蛋白之間的相互作用，對于闡述 β-synuclein的神經保護作用具有重要的意義，但目前國內外關于這方面的研究報道甚少。本研究原核細胞表達帶有 GST標簽的βsynuclein融合蛋白，為通過GST pull down等方法研究β-synuclein與其他蛋白之間相互作用的研究打下良好的基礎。

1 材料方法

1.1 材料

腦組織來源于流產胎兒腦組織;質粒pGEX-6P-1和大腸桿菌 BL21、DH5α為本實驗室保存;Trizol、T4DNA連接酶及Pyrobest DNA polymerase購自寶生物工程有限公司;BamHI和 XhoI內切酶、逆轉錄試劑盒、DNA marker-D、蛋白 marker及 pCUm-T載體購自上海生工生物工程技術服務有限公司。

1.2 方法

1.2.1 RT-PCR:用Trizol從腦組織中抽提總 RNA，取1 μg RNA作為逆轉錄模板，采用 AMV First Strand cDNA Synthesis試劑盒進行 RT反應。按照試劑盒說明進行操作。

1.2.2 β-synuclein基因的克隆與鑒定:根據Genbank(ID6620)報道序列設計引物，上游引物:5′-GGATCCAGGATGGACGTGTT CATG-3′(含 BamHI酶切位 點)，下 游 引 物:5′-CTCGAGCCTACGCCTCTGGC TCATACT-3′(含 XhoI酶切位點)。采用 Pyrobest DNA polymerase進行PCR擴增。PCR反應條件為:94℃預變性 2 min，循環數為 30，94℃變性 40 s，50℃退火 40 s，72℃延伸90 s，循環結束后再72℃延伸10 min。

1.2.3 pCUm-T-β-synuclein的構建:PCR產物加“A”后與 pCUm-T載體4℃進行連接。取5 μL連接反應液轉化 DH5α感受態細菌，進行藍白斑篩選。挑取白色克隆，少量提取質粒，用BamHI和XhoI雙酶切和PCR反應初步鑒定陽性克隆。將酶切鑒定和PCR反應正確的細菌克隆送交上海生工生物工程技術服務有限公司測序。

1.2.4 原核表達載體的構建:測序正確的質粒pCUm-T-β-synuclein用BamHI和XhoI進行雙酶切，純化回收 419 bp大小的目的片段，與 BamHI和XhoI雙酶切的質粒 pGEX-6P-1 4℃反應16 h，然后轉化大腸桿菌BL21感受態細菌。少量提取質粒，用BamHI和XhoI雙酶切和PCR反應鑒定陽性細菌克隆，獲得pGEX-6P-β-synuclein原核表達載體。

1.2.5 原核蛋白的誘導表達:將鑒定正確的菌株常規培養至對數中期(A600為0.5～1.0)，IPTG(終濃度1 mmol/L)誘導6 h收獲菌體，PBS重懸后加入溶菌酶(終濃度 1 mg/mL)，冰上放置30 min后，將0.2%Triton X-100注入裂解物中，劇烈震蕩混勻后加入DNase和 RNase(終濃度 5 μg/mL)。震蕩 10 min后，4℃ 3000 r/min離心 30 min，提取上清并加入 DTT至終濃度1 mmol/L，用0.45 μm濾膜過濾。使用10%聚丙烯酰胺凝膠進行SDS-PAGE電泳后。

1.2.6 考馬斯亮藍R250染色:將凝膠放至五倍體積的考馬斯亮藍R250染色液中，搖床上室溫緩慢旋轉3～4 h。換掉染液，用無染料的甲醇/醋酸溶液浸泡凝膠，緩慢搖動4～8 h脫色，其間換3～4次溶液。繼續脫色24 h后，用掃描儀掃描凝膠圖像。

2 結果

2.1 RT-PCR結果

擴增后的PCR產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳分離后得到一條約420 bp的特異條帶，與目的基因βsynuclein的大小一致(圖1)。

1.PCR產物;M.DNA marker-D圖1 RT-PCR結果1.PCR products;M.DNA marker-DFig.1 Electrophoresis results of RT-PCR

2.2 pCUm-T-β-synuclein的構建與鑒定

挑取白色克隆，小提質粒后進行 PCR、酶切和測序鑒定。重組質粒經BamHI和XhoI酶切后得到預期的約420 bp和2800 bp大小的兩條片段，PCR擴增得到一條約 420 bp大小的條帶(圖2)。對PCR和酶切鑒定的克隆送上海生工進行測序，測序結果與 Genbank序列(ID6620)進行 Blast序列比對，堿基序列完全一致(結果略)。證實目的基因已經克隆到pCUm-T載體中。

2.3 原核表達載體的構建與鑒定

pGEX-6P-β-synuclein經 PCR擴增得到一條約420 bp大小的條帶(圖3)。證實目的基因已經克隆到pGEX-6P-1原核表達載體中。

2.4 β-synuclein原核蛋白的表達

將 pGEX-6P-β-synuclein轉化大腸桿菌 BL21，經IPTG誘導，收集菌體進行 SDS-PAGE電泳，考馬斯亮蘭R-250染色后在預期位置約40×103處有明顯的蛋白條帶，而未經誘導的重組質粒轉化細菌在相應位置則沒有相應的蛋白條帶(圖4)，說明該蛋白在大腸桿菌BL21中成功表達。

1.PCR products;2.BamHI和XhoI酶切結果;M.DNA marker-D圖2 重組 pCUm-T-β-synuclein的鑒定1.PCR products;2.pCUm-T-β-synucleindigestedbyBamHIand XhoI;M.DNA marker-DFig.2 Identification of pCUm-T-β-synuclein

M.DNA marker-D;1.PCR products圖3 重組 pGEX-6P-β-synuclein PCR鑒定結果M.DNA marker-D;1.PCR productsFig.3 Identification of pGEX-6P-β-synuclein by PCR

1.pGEX-6P-β-synuclein 經誘導;2.pGEX-6P-β-synuclein 未經誘導;M.蛋白Marker圖4 重組蛋白β-synuclein的鑒定1.Induced pGEX-6P-β-synuclein; 2.Non-induced pGEX-6P-βsynuclein;M.Protein markerFig.4 Expression of β-synuclein analyzed by SDS-PAGE

3 討論

β-synuclein沒有聚集形成原纖維的傾向，不具有神經細胞毒性作用［4］，能夠明顯的改善由 αsynuclein聚集引起的神經元變性，對神經元細胞有明顯的保護作用［5］。β-synuclein對PD的這種神經保護作用可能與以下因素有關:(1)β-synuclein具有抗氧化作用，能夠抑制α-synuclein依賴的氧化應激［6］;(2)β-synuclein能夠抑制 α-synuclein 的表達，從而抑制α-synuclein的神經毒性作用［7］。

但具體的保護機制尚未完全明了，這也是目前應用β-synuclein進行PD治療的主要障礙。

GST pull down是一種經典的用來研究蛋白相互作用的有效方法，為了發現能夠與β-synuclein相互作用的蛋白，我們采用RT-PCR法從胚胎腦組織中克隆人β-synuclein基因，并將其克隆至谷胱甘肽S-轉移酶(GST)融合表達載體pGEX-6P-1中?；蚪洔y序證實擴增的目的序列與所需的人β-synuclein基因序列一致，適用于后續的基因表達。我們按照IPTG終濃度1 mmol/L，培養6 h進行蛋白的誘導、收獲與檢測，在蛋白電泳圖中可見約40×103的新增蛋白條帶，說明我們已經成功在大腸桿菌中誘導β-synuclein融合蛋白，提取該蛋白的方法可行，為下一步谷胱甘肽親和柱純化β-synuclein融合蛋白、GST pull down捕獲與β-synuclein作用的蛋白及研究其在PD發病機制中的作用奠定了良好的基礎。

［1］ Goedert M.Alpha-synuclein and neurodegenerative diseases［J］.Nat Rev Neurosci，2001，2(7):492－501.

［2］ Yamin G，Munishkina LA，Karymov MA，et al.Forcing nonamyloidogenic beta-synuclein to fibrillate［J］.Biochemistry，2005，44(25):9096－9107.

［3］ Jakes R，Spillantini MG，Goedert M.Identification of two distinct synucleins from human brain［J］.FEBS Lett，1994，345(1):27－32.

［4］ Wood SJ，Wypych J，Steavenson S，et al.alpha-synuclein fibrillogenesis is nucleation-dependent. Implications for the pathogenesis of Parkinson's disease［J］.J Biol Chem，1999，274(28):19509－19512.

［5］ Hashimoto M，Rockenstein E，Mante M，et al.beta-synuclein inhibits alpha-synuclein aggregation:a possible role as an antiparkinsonian factor［J］.Neuron，2001，32(2):213－223.

［6］ Windisch M， Hutter-PaierB， Rockenstein E， etal.Development of a new treatment for Alzheimer's disease and Parkinson's disease using anti-aggregatory β-synuclein-derived peptides［J］.Mol Neurosci，2002，19(1－2):63－69.

［7］ Fan Y，Limprasert P，Murray IV，et al.β-synuclein modulates α-synuclein neurotoxicity by reducing α-synuclein protein expression［J］.Hum Mol Genet，2006，15(20):3002－3011.

Construction of Prokaryotic Expression Vector of β-Synuclein and Expression in E.coli BL21

CHEN An-qi1，LIU Xue-jie2，CUI Xiao-dong1，LIU Jiang-yue1，ZHANG Dai-juan1，GUO Jun-tang1
(1.Department of Basic Medicine;2.Affiliated Hospital，Weifang Medical University，Shandong Weifang 261053，China)

ObjectiveTo construct a prokaryotic expression vector of β-synuclein and analyze its expression in E.coli BL21.MethodsTotal RNA was isolated from human fetal brain tissue.The full-length human β-synuclein cDNA was obtained by RT-PCR and then inserted into pCUm-T vector for sequencing.The target gene fragment was subcloned into pGEX-6P-1 vector correctly and then transformed into E.coli BL21.The expression of β-synuclein was induced with IPTG，and analyzed by SDS-PAGE.Resultsβ-synuclein was amplified by RT-PCR and subcloned into pGEX-6P-1 properly.The recombinant fusion protein was expressed in E.coli BL21.ConclusionThe prokaryotic expression vector of β-synuclein has been successfully constructed and expressed in E.coli BL21，providing a foundation for the further study of β-synuclein in Parkinson's disease.

β-synuclein;Parkinson's disease;Gene expression;E.coli

R742

A

1005-4847(2010)06-0495-03

10.3969/j.issn.1005－4847.2010.06.010

2010-03-23

山東省衛生廳青年基金(2007QW007);濰坊醫學院博士啟動基金。

陳安琪(1981－)，講師，研究方向為帕金森病發病機制。

郭軍堂(1973－)，男，副教授，研究方向:帕金森病發病機制。E-mail:guojuntang@sohu.com