抗藍氏賈第鞭毛蟲藥物研究進展

馮憲敏,朱 楓,藏秋雨(綜述),盧思奇(審校)

2.首都醫科大學病原生物學系,北京 100069

抗藍氏賈第鞭毛蟲藥物研究進展

馮憲敏1,朱 楓1,藏秋雨1(綜述),盧思奇2(審校)

2.首都醫科大學病原生物學系,北京 100069

藍氏賈第鞭毛蟲(Giardia lamblia Stile,1915,亦稱G.intestinalis或G.duodenalis,簡稱賈第蟲),是一種厭氧的(anaerobic)寄生性原生生物。其生活史包括滋養體(trophozoite)和包囊(cyst)兩個發育階段。前者為蟲體的致病期(或營養和繁殖期),寄生于人和某些哺乳動物小腸內導致以腹瀉和消化不良為主要癥狀的藍氏賈第鞭毛蟲病(giardiasis,簡稱賈第蟲病);后者為感染期(或靜止期),由滋養體在小腸內分泌成囊物質形成,之后隨宿主糞便排出體外而具感染性。

賈第蟲的感染不僅廣泛流行于發展中國家,即使在美國也是水傳腹瀉暴發流行的最常見原因。在特定區域,被賈第蟲包囊污染的水源常引起旅游者腹瀉。本病已被列為全世界危害人類健康的十種主要寄生蟲病之一。本蟲世界范圍的感染率約為1%～20%,我國的感染率平均為2.54%左右。藍氏賈第鞭毛蟲合并HIV/AIDS的感染,及其在同性戀者中流行的報道不斷增多。本文將就近年抗賈第蟲藥物的研究進展和新靶點的開發作一回顧。

1 抗賈第蟲新藥研發的意義

目前,臨床上治療賈第蟲病的首選藥物是甲硝唑(250～ 750mg,口服 ,3 次/日 ,療程 2～ 5w)〔1-2〕。由于一方面,賈第蟲病患者多為慢性期,病程長,需要長期大量用藥。而療程越長,劑量越大,甲硝唑的不良反應也就越多。最常見的是胃腸道反應,嚴重者可出現消化道的大出血;部分患者還可出現神經系統癥狀,血液系統反應,重者可患心肌炎,甚至致癌。孕期是甲硝唑的禁忌癥,因為其可引起胎兒的畸形〔2〕,因此極大地限制了甲硝唑在本病治療中的應用。

另一方面,甲硝唑通過抑制原蟲的氧化還原反應,使原蟲的氮鏈發生斷裂,因此對原蟲有殺傷作用,這一作用的發揮有賴于藥物本身可以進入到蟲體內。但是賈第蟲除了滋養體致病以外,最重要的傳播階段是包囊。在長期應用藥物治療的過程中,部分滋養體發生耐藥而成囊。由于包囊壁的保護作用,甲硝唑對原蟲的包囊不發揮殺傷作用,并且,甲硝唑作用后,雖然蟲體死亡,但微絲結構無破壞,說明甲硝唑不能損傷蟲體微絲結構。因此不能阻斷賈第蟲病的傳播。正是由于上述原因,使得抗賈第蟲新藥的研發成為亟待解決的問題。

2 抗賈第蟲新藥研究進展

在研究賈第蟲病治療藥物的過程中,尋找新的藥物作用靶點至關重要,其中與其致病關系密切的形態結構、關鍵的代謝酶、與蟲體增殖相關的結構等都可作為藥物作用的靶點。

2.1 以細胞骨架為靶點的抗賈第蟲藥物 賈第蟲的細胞骨架結構復雜,與蟲體致病力密切相關,對細胞骨架有損傷作用的藥物均可使賈第蟲的吸盤喪失吸附功能而失去致病能力。因此,賈第蟲細胞骨架的成分是新藥物篩選的有效候選靶點。

目前,將作用于賈滴蟲細胞骨架的藥物分為三類:(1)作用于微管結構的藥物(如秋水仙堿和諾考達唑)(2)作用于微絲的藥物(如細胞松弛素)(3)苯并咪唑類藥物。其中苯并咪唑類藥物作用效果較明顯。(4)青蒿素類。

苯并咪唑類衍生物(1,3,9,15H-benzimidazole)可抑制微管蛋白的聚合作用。用流式細胞儀對體外賈第蟲滋養體對藥物敏感性的評價結果也顯示,該類藥物對細胞骨架有損傷作用〔3〕苯并咪唑類藥物敏感株和不敏感株的微管蛋白對苯并咪唑類化合物的再結合力實驗表明,苯并咪唑的衍生物對蟲體的α和β-微管蛋白有再結合能力。敏感株再結合β-微管蛋白的親和常數明顯高于非敏感株。幾種苯并咪唑衍生物(albendazole、Fenbendazole、mebendazole)也在敏感株表現出對單聚體β-微管蛋白和異二聚體α-β-微管蛋白的高親和性〔4〕。另有報道顯示,電鏡下觀察發現苯并咪唑類藥物可結合微管,使吸盤解體,影響細胞骨架的功能〔5〕。

青蒿素是從菊科艾屬植物黃花蒿(Artemisia annua)莖葉部分離提取出來的一種含過氧基團的倍半萜內酯,是我國學者首先發現的新型抗瘧藥物。青蒿素體內代謝活性產物為其衍生物之一的雙氫青蒿素(Dihydroartemisinin,DHA),用特異性標記染料羅丹明-鬼筆環肽(RDP)和紫杉醇(P22310)分別標記微絲和微管,激光共聚焦顯微鏡觀察結果顯示雙氫青蒿素不僅對蟲體細胞骨架而且對細胞超微結構均有損傷,從而起到對藍氏賈第鞭毛蟲的殺傷作用。

紫杉醇(Tau)和紫杉酚(Taxol)是一種抗有絲分裂藥物。Tau誘導Taxol結合到微管網格結構的兩種配體上。Tau是一種微管相關蛋白,結合在α-β tubulin的外部,二者均降低微管蛋白的聚合。Tau也單獨作用于微管束,使堅固(stiffen)空間。

2.2 以代謝酶為靶點的抗賈第蟲藥物 作為一種缺乏線粒體的寄生性原核生物(archezoa),賈第蟲生命活動中的能量代謝并不具備由細胞色素介導的氧化磷酸化過程,而是依靠糖酵解途徑獲取能量(即使在有微量氧存在的環境中也是如此)。其代謝方式與細菌有許多共同之處,即無氧酵解能量代謝依賴焦磷酸鹽而非依賴三磷酸腺苷的三羧酸循環途徑〔6〕。在此種過程中需要某些酶類參與催化和調節。因此,這些酶類在抗賈第蟲藥物研究中逐漸引起了人們的關注。

丙酮酸鐵氧化還原酶(PFOR)在賈第蟲體內催化鐵氧化還原蛋白的生成。鐵氧化還原蛋白是甲硝唑發揮抗賈第蟲作用的重要媒介。當藥物進入滋養體內,通過蟲體電子傳遞蛋白(鐵氧化還原蛋白)將蟲體的電子傳遞到藥物分子的硝基上,藥物就被這一還原的硝基所活化,還原的甲硝唑作為終末電子受體共價結合到蟲體的DNA大分子上,引起蟲體DNA斷裂,雙螺旋結構被破壞,喪失其模板功能,阻止轉錄與復制,最終導致細胞死亡。當蟲體的PFOR活性下降時,賈第蟲表現出明顯的耐藥〔7〕。呋喃唑酮通過抑制細菌的氧化還原酶而發揮抑菌作用,可使賈第蟲細胞內的核糖體和糖原較對照組減少〔8〕。

3 新藥靶點篩選

3.1 以PPi依賴的代謝酶為靶點的抗賈第蟲藥物篩選 從代謝的角度而言,經典的糖酵解途徑是碳代謝的起點。對于需氧的真核生物,糖酵解途徑所產生的能量是微不足道的。它們95%的ATP來源于后續的三羧酸循環(tricarboxylic acid cycle reactions)和氧化磷酸化(oxidative phosphorylation)過程。相比較而言,那些無線粒體的厭氧或微需氧的原真核生物,其ATP產出則主要依賴糖酵解過程,這種代謝的特點給這些生物的能量代謝帶來了選擇性的壓力。一些原真核生物為此發生許多有意義的適應性改變。在前期工作中,我們驗證了PPDK是賈第蟲糖酵解途徑的關鍵酶〔9〕。由于PPDK不存在于高等的哺乳動物,因此成為新型抗賈第蟲藥物研發的理想候選靶點。截至目前,尚未見有關PPDK抑制劑作用于賈第蟲的相關報道。

3.2 酸性鈣離子體為靶點的藥物研發

雙磷酸鹽(Bisphosphonates)類藥物,通常用于治療各種骨吸收性疾病,如骨質疏松、惡性腫瘤引起的高鈣血癥、及腫瘤的骨轉移等。有證據表明,大多數活性雙磷酸鹽類藥物抗原蟲作用的靶點均為類異戊二烯合成途徑中的關鍵酶即法呢基焦磷酸合成酶(FPPS):(1)體外實驗證明包括布氏錐蟲(T.brucei)〔20〕、剛地弓形蟲(T.gondii)〔11〕、利氏曼原蟲(L.major)〔12〕在內的原蟲的生長與 FPPS密切相關;(2)體內抗蟲實驗證明雙磷酸鹽類藥物能有效抑制布氏錐蟲的繁殖,使病情得到逆轉〔11〕;(3)分子模式和結構活性調查顯示,來自不同蟲種的FPPS具有相似的藥效團〔13〕;(4)應用基因工程的手段篩選FPPS過表達的T.gondii蟲株,結果表明FPPS過表達蟲株對雙磷酸鹽類藥物具有較高的抵抗力,而阿托奎酮(對FPPS無抑制作用)的IC50未受到影響〔14〕。

該酶類存在于腸道寄生原蟲溶組織阿米巴,且含氮芳香烴鏈雙磷酸具有較高的殺蟲效果,可有效降低阿米巴肝膿腫的發生〔15〕。由于賈第蟲的能量代謝主要依賴PPi,因此雙磷酸鹽類藥物具有潛在的抗賈第蟲作用。

〔1〕Kiser JD,Paulson CP,Brown C.Clinical inquiries.What＇s the most effective treatment for giardiasis〔J〕 .J Fam Pract,2008,57(4):270-272.

〔2〕徐春玲.甲硝唑臨床應用中的不良反應〔J〕.中華醫藥指南,2008,6(16);500-589.

〔3〕Karabay O,T amer A,Gunduz H,et al.Albendazole versus metronidazole treatment of adult giardiasis:An open randomized clinical study〔J〕.World J Gastroenterol,2004,10(8):1215-7.

〔4〕Campanati L,Monteiro-Leal LH.Effects of the antiprotozoal drugs metronidazole and furazolidone on trophozoites ofGiardia lamblia(P1 strain)〔J〕.Parasitol Res,2002,88:80-85.

〔5〕Busatti HG,Santos JF,Gomes MA.T he old and new therapeutic approaches to the treatment of giardiasis:Where are we〔J〕.Biologics,2009,3:273-87.

〔6〕Brown DM,Upcroft JA,Edwards M R,et al.Anaerobic bacterial metabolism in the ancient eukaryoteGiardia duodenalis〔J〕.Int J Parasitol,1998,28(1):149-164.

〔7〕Meixia D,Wang AL,Wang CC.Inhibition of py ruvate-ferredoxin oxidoreductase gene expression inGiardia lambliaby a virus-mediated hammerhead ribozyme〔J〕.Mol Microbiol,2000,36(2):447-456.

〔8〕Hausen MA,Freitas JC,M onteiro-Leal LH.The effects of metronidazole and furazolidone duringGiardiadifferentiation into cysts〔J〕.Ex p Parasitol,2006,113(3):135-41.

〔9〕Feng XM,Cao LJ,Adam R D,et al.The cataly zing role of PPDK inGiardia lamblia〔J〕.Biochem Biophy s Res Commun,2008,367:394-398.

〔10〕Roberto D,Silvia NJ.The acidocalcisome as a target for chemotherapeutic agents in protozoan parasites〔J〕.Curr Pharm Des,2008,14(90:882-888.

〔11〕Ling Y,Li ZH,Miranda K,et al.T he farnesyl diphosphate/geranylgeranyl diphosphate synthase ofToxoplasma gondiiis a bifunctional enzyme and a molecular target of bisphosphonates〔J〕.J Biol Chem,2007,282:30804-30816.

〔12〕Sanders JM,Song Y,Chan JM,et al.Pyridinium bisphosphonates are potent inhibitors of farnesyl diphosphate synthase and bone resorption 〔J〕.J Med Chem,2005,48:2957-63.

〔13〕Srivastava A,Mukherjee P,Desai PV,et al.Structural analysis of farnesyl pyrophosphate synthase from parasitic protozoa,a potential chemotherapeutic target〔J〕 .Infect Disord Drug Targets,2008,8(1):16-30.

〔14〕Ortiz-Gomez A,Jimenez C,Estevez AM,et al.Farnesyl diphosphate synthase is a cy tosolic enzyme inLeishmania major promastigotesand its overexpression confers resistance to risedronate〔J〕.Eukaryot Cell,2006,5:1057-64.

〔15〕Ghosh S,Chan JM,Lea CR,et al.Effects of bisphosphonates on the growth ofEntamoebahistolyticaandPlasmodiumspeciesin vitro and in vivo〔J〕.J Med Chem,2004,47:175-87.

R382.9

A

1002-2694(2010)08-0779-02

馮憲敏,Email:xianmin08.student@sina.com

1.吉林醫藥學院病原教研室,吉林 132013;

2010-02-18;

2010-04-21