人腸道病毒71型動物模型研究進展

劉江寧，張連峰，2

(1.中國醫學科學院實驗動物研究所，衛生部人類疾病比較醫學重點實驗室，北京 100021;

2.中國醫學科學院實驗動物研究所，國家中醫藥管理局人類疾病動物模型三級實驗室，北京 100021)

人腸道病毒71型動物模型研究進展

劉江寧1，張連峰1，2

(1.中國醫學科學院實驗動物研究所，衛生部人類疾病比較醫學重點實驗室，北京 100021;

2.中國醫學科學院實驗動物研究所，國家中醫藥管理局人類疾病動物模型三級實驗室，北京 100021)

人腸道病毒71型是嬰幼兒手足口病的致病原之一，其嚴重的并發癥可導致神經系統疾病，甚至死亡，是近期威脅中國兒童健康的因素之一。目前尚無臨床疫苗可以預防該病毒感染，而EV71的動物模型是進行致病機理、疫苗評價和藥物等研究的基礎。本文對EV71的兩種常用動物模型:小鼠和獼猴(Macaca mulatta)模型進行了描述，并對其在研究中的應用給與概括，為研究者選擇合適的動物模型提供了依據。

人腸道病毒71型;手足口病;模型，動物

1969年，研究者首次從患有中樞神經系統疾病的嬰兒糞便標本中分離得到腸道病毒71型(Enterovirus 71，EV71)，Schmidt等［1］1974年鑒定。EV71病毒屬于微小病毒科腸道病毒屬，為單股正鏈RNA病毒［2］。1974年以來，EV71病毒曾在世界范圍內多次暴發，主要引起嬰幼兒(0～6歲)手足口病(HFMD)和無菌性腦膜炎、腦干腦炎和脊髓灰質炎樣的麻痹等多種與神經系統相關的疾病，而中樞神經系統感染導致的肺水腫、肺出血和心肌炎，使其致殘和病死率較高。每次疫情暴發，均會奪走許多嬰幼兒的生命［3］。到目前為止，臨床上尚無預防EV71病毒感染的疫苗或針對性治療藥物，理想的動物模型是解決以上問題的關鍵之一，本綜述對EV71病毒在中國的流行特點，現有的動物模型及其應用進行了概括。

1 EV71病毒流行特點及中國疫情

根據病毒的VP1基因序列，EV71可分為A、B和C三種基因型，包含A、B1－B5和C1－C5共11個亞型［4］。在1997～2005年馬來西亞的暴發中，重癥EV71感染以C1、C2、B3、B4和B5亞型為主［4］。在1999～2007年，澳大利亞的重癥EV71感染以C1亞型為主［5］。2004年臺灣首次出現了C4亞型毒株的流行，2006～2007年間，臺灣的EV71暴發以B5和C5亞型為主［6］。而中國的EV71暴發主要以C4亞型為主，偶爾有C5亞型感染的報道［7］。EV71不同型毒株之間，在毒力方面并無明顯差異，各種基因型的EV71均有引發嚴重癥狀的報道［8］。

1997年以來，EV71病毒的流行在亞太地區呈上升趨勢［4，6，7］。1981年，我國在上海發現手足口病，隨后北京、河北、天津、福建、吉林、山東、湖北、廣東和安徽等十幾個省(市)相繼出現疫情。2008年EV71導致的手足口病疫情在多個省市暴發，2009年1～4月，全國累計報告手足口病例115 618例，重癥773例，死亡50例，由于死亡的都是嬰幼兒，引起很大的社會恐慌。李仁清等［9］分析了北京2006～2008年間的流行毒株的序列，發現北京地區流行的EV71仍然是C4亞型，并且在同一時期的不同地區、不同來源和不同疾病狀態下分離的毒株在VP1序列上無明顯差別。但是隨著時間推移，核苷酸變異的不斷積累，有出現新亞型毒株的可能。

2 EV71病毒的動物模型

2.1 小鼠模型

EV71感染的1日齡新生ICR或BALB/c小鼠是最為常見的EV71模型動物。臨床分離毒株對肌肉組織的噬性高于腦組織，臨床分離株經過小鼠體內扶強后，可以引發神經癥狀，甚至可以感染1周齡或兩周齡的小鼠。

Chumakov等［10］使用B1亞型的保加利亞臨床分離株感染1日齡的新生小鼠，可引發癱瘓和肌炎及肌纖維壞死。Arita等［11］將B1亞型的EV71毒株在NOD/SCID小鼠顱內傳代扶強，分離到了一株NOD/SCID小鼠適應毒株，該毒株感染3～4周齡的NOD/SCID小鼠后，可以使其表現出后肢麻痹。

Chua等［12］將B3亞型的澳大利亞臨床分離株在BALB/c小鼠顱內扶強，扶強后的毒株感染1～7日齡BALB/c小鼠，引發了嚴重的致死癥狀，骨骼肌是病毒的主要復制位點，病毒侵染引發嚴重的壞死性肌炎。Chan等［13］用B3和B4亞型的EV71作為出發毒株，建立了1日齡ICR小鼠的感染模型，對小鼠進行顱內病毒感染后，小鼠均出現明顯的體重增長減緩，而B3亞型毒株感染2 d后可觀察到嗜睡和運動不協調癥狀，部分小鼠四肢腫脹并伴隨死亡，未發現后肢麻痹癥狀，而未死亡的小鼠在感染6 d后，上述癥狀全部消失，恢復正常。Chen等［14］用C2亞型的小鼠適應株通過灌胃感染1日齡的ICR小鼠，2 d后，小鼠可出現皮膚病變，一般在4～7 d后出現后肢麻痹，7～9 d后死亡，病理觀察發現了腦部的淋巴細胞浸潤。隨后，Wang等［15］將上述C2亞型毒株在1日齡的ICR小鼠顱內4次傳代扶強后，得到MP4菌株。扶強菌株在體內外的毒力均比出發菌株增強，且扶強后的毒株可通過灌胃法感染7日齡ICR小鼠，導致其后肢麻痹，并在5～9 d內死亡。病理觀察到了感染小鼠的腦干與脊髓中神經元消失和凋亡，四肢肌肉大面積壞死。感染早期，可在小鼠的小腸內檢測到病毒復制，而病毒的主要復制位點是在肌肉、脊髓與腦中。同時，MP4感染小鼠后，可發生同窩之間的交叉感染現象。

Ong等［16］使用B3亞型的小鼠適應株，通過灌胃與注射感染2周齡的ICR小鼠，小鼠感染后表現出腦脊髓炎等與人類似的神經癥狀，感染小鼠的前角神經元、三叉神經運動核和腦干網狀結構的神經元中病毒數量最多，腦的其他部位也有少量的神經元被感染。該模型是迄今為止，能感染EV71病毒的年齡最大的正常小鼠。Wu等［17］將新分離的EV71的neu毒株在Vero細胞中進行兩輪培養，得到YN3毒株，其通過腹腔感染新生ICR小鼠時表現出較高的毒力，可致新生的ICR小鼠后肢麻痹，最終死亡。

中國大陸地區的EV71流行株主要屬于C4亞型，而實驗動物普遍對該毒株不敏感，導致多數病毒株感染動物后，不能表現出明顯的臨床癥狀。朵建英等［18］通過腹腔注射對1日齡的ICR小鼠進行病毒感染，隨后在腦、肺、骨骼肌與小腸中檢測到了病毒復制，繪制了病毒在骨骼肌內的復制曲線，并聯合組織的病理變化，建立了我國流行的C4亞型毒株的小鼠模型。

2.2 非人靈長類模型

口服EV71病毒不能使獼猴產生嚴重的神經癥狀，獼猴免疫與攻毒多使用椎管或靜脈注射接種［19，20］。Chumakov等［10］使用保加利亞臨床分離株感染獼猴之后，可使獼猴發生癱瘓，神經系統出現類似于脊髓灰質炎的病變。Nagata等［19］分別用5種EV71的臨床分離株(患者分別患有腦炎，腦膜炎和手足口病)，通過椎管注射對獼猴(5～13歲，成年雌性)進行病毒感染，1～6 d后，獼猴均表現出了神經癥狀:遲緩性麻痹、震顫和共濟失調，免疫組化證實了病毒在脊髓、腦干、小腦皮層、齒狀核和大腦中的復制。隨后，Nagata等［20］進一步建立了靜脈注射感染獼猴的模型，獼猴(6～17歲，成年雌性)感染病毒后，具有與人腦炎類似的臨床體征與神經病理表現，包括震顫、共濟失調和腦水腫，但沒有發生諸如肺水腫和心臟衰竭之類的神經源性并發癥。值得注意的是，許多EV71病毒的臨床分離株對獼猴感染時，表現出了較低的神經毒性［21］。國內未見使用猴建立感染模型的報道。

3 動物模型的應用

3.1 病毒在體內的傳遞及致病機制研究

病毒在體內的傳播途徑，是發病機制研究的焦點之一。Chen等［14］用C2亞型小鼠適應株通過灌胃感染小鼠，組織內病毒滴度實驗表明，病毒首先在小腸內復制并引發病毒血癥，隨后依次傳播到脊髓的胸段、頸段和腦干中，推測病毒利用逆向軸突的傳遞的方式進入腦內復制，這一點與脊髓灰質炎病毒類似。隨后，Chen等［22］通過灌胃、肌內注射和顱內注射三種方式對7日齡小鼠進行感染后，均導致腦部感染、松弛型麻痹、肺功能失調和死亡。然而，不同的感染方式影響了疾病進展和發生神經癥狀的概率，與其他兩種感染方式相比，顱內注射感染，可導致小鼠的死亡提前發生，表明從病毒接種到病毒傳遞到顱內的時間長短，決定了疾病發生的潛伏期長短。雖然灌胃感染可引發病毒血癥，但是不引發明顯的神經癥狀，預示著血液運輸并不是病毒傳遞的主要方式。后肢感染病毒后，首先會在脊髓的腰段檢測到病毒，隨后傳遞到脊髓的頸段，最后抵達腦部;而上肢感染病毒后，則首先在脊髓的頸段檢測到病毒，從而得出EV71病毒依賴神經元逆向傳遞的結論。Ong等［16］發現，通過肌內注射感染2周齡小鼠，病毒進入骨骼肌后，通過運動神經感染附近的中樞神經，并在中樞神經系統內傳遞。

關于EV71病毒的致病機理，目前尚不清楚。病毒感染引發的嚴重神經癥狀，普遍被認為是病毒在腦組織的復制引起的。然而，隨后的解剖數據表明，許多患者體內的病毒復制與病變部位并不一致，并推測宿主免疫系統在發病過程中扮演了重要的角色［23］。Hashimoto等［24］用臨床分離的毒株經皮下注射感染獼猴，結果一半的獼猴感染后表現出臨床癥狀:后肢麻痹或衰弱。病理分析發現了神經系統和血管的病變，以及脊髓、延髓、大腦和腦干灰質中的神經元變性消失和炎細胞侵潤。但是，在這些部位均未發現病毒復制，而血清中EV71抗體的濃度卻顯著升高，這預示著除了病毒復制以外，可能存在其他致病機制，如免疫過激或交叉免疫反應等［25］。

3.2 疫苗評價

預防EV71病毒感染的疫苗，均處于研究階段，目前尚無臨床上可以使用的疫苗。獼猴模型中，因為可以感染病毒的獼猴年齡較高，可以用做疫苗的自體免疫評價。Arita等［26］使用減毒的A型EV71病毒做為疫苗，對獼猴進行免疫，45 d后經靜脈注射進行攻毒，免疫后的獼猴沒有表現出癥狀，且其血清對不同亞型的EV71毒株(A、B1、B4、C2和C4)具有廣譜性的中和作用。然而，從減毒毒株接種的獼猴脊索中，分離到了活病毒，表明弱毒株仍具有一定的神經侵染性，并引發了獼猴的震顫等微弱的神經癥狀。

由于小鼠對EV71病毒的敏感期較短，限制了其在疫苗評價中的使用。目前，國際上多采用對雌鼠或母鼠免疫，疫苗產生的抗體可以通過胎盤屏障傳遞給幼鼠，隨后對幼鼠進行病毒感染，從而間接的評價母源抗體對幼鼠的保護作用。使用此類方法評價的疫苗，包括滅活的病毒、病毒結構類似物、VP1蛋白及VP1的DNA疫苗。Wu等［17］比較了滅活全病毒疫苗、VP1的DNA疫苗和VP1蛋白對雌鼠免疫后，母源抗體對幼鼠的保護能力。雌鼠經滅活病毒免疫后，再交配產下的的幼鼠，經2300LD50的病毒劑量感染時，存活率達到80%，而母鼠經VP1蛋白的DNA疫苗和VP1蛋白免疫后產下的的幼鼠，在230 LD50的病毒劑量感染時，存活率分別為40%和80%，指出滅活全病毒作為疫苗具有最佳的保護效果。Chung等［27］表達并純化了EV71病毒類似物—VLP，VLP模仿了全病毒的形狀、衣殼蛋白結構和蛋白組成。免疫后的BALB/c母鼠產下的幼鼠，在受到EV71病毒(1000 LD50)攻擊時，存活率可以達到89%，其保護活性大于變性的VLP蛋白和熱滅活的EV71病毒。

Ong等［28］使用2周齡ICR小鼠的感染模型，對甲醛滅活的全病毒疫苗進行了自體免疫評價。對1日齡的新生鼠進行初次免疫，7 d后進行加強免疫。加強免疫7 d后的幼鼠進行病毒感染，結果均未表現出癥狀，各組織也未檢測到病毒。

3.3 藥物篩選

抑制EV71病毒的藥物研究，多處于細胞水平上，在動物模型中對于藥物治療效果進行驗證的報道并不多見，概因為感染病毒的幼鼠存在年齡過低、感染周期短和不宜進行給藥等缺點。Li等［29］對12～14 d的ICR小鼠進行腹腔注射感染病毒，感染后2 h開始腹腔注射利巴韋林藥物，每日劑量為100 mg/(kg·bw)，持續給藥9 d，發現利巴韋林可以通過抑制組織內的病毒復制，來降低小鼠在面臨病毒感染時的發病率、致死率(致死率降低到30%)和麻痹后遺癥。Liu等［30］研究了I型IFNs對病毒感染的幼鼠的治療效果，對3日齡的ICR小鼠進行腹腔注射攻毒，感染2～3 d后注射地塞米松(I型IFNs的抑制劑)，會加劇臨床癥狀，增加組織內病毒滴度。而在病毒感染前12 h注射IFN素的誘導劑，則會提高成活率和降低組織內病毒滴度。注射I型IFN的抗體，則會提高死亡率和組織內病毒滴度。并且，在感染病毒后的3 d內，連續3 d注射IFN－αA，則會使幼鼠存活。Weng等［31］發現，牛乳鐵蛋白在小鼠體內具有抗病毒效果，它可以延緩麻痹，降低死亡率。但是治療組的死亡率依然達到了70%，表明其體內治療效果微弱。

4 展望

EV71病毒被認為是脊髓灰質炎病毒被撲滅后，目前最重要的嗜神經性腸道病毒。然而，由于該病毒的流行地區主要是經濟不發達的亞太地區，不能引起發達國家的足夠重視，導致其研究進展不夠迅速。關于EV71病毒感染的致病機理，目前尚不清楚;沒有臨床上可以使用的疫苗和針對性治療藥物，使疫情在很長時間內難以得到緩解，而解決上述問題的關鍵，是建立理想的模型。猴模型雖然可以滿足上述要求，但是價格昂貴，不適合大規模藥物篩選研究;目前小鼠的感染年齡過低，感染周期短，限制了其在疫苗的自體免疫評價和藥物篩選中的應用。而進一步提高可感染病毒的小鼠年齡，甚至建立成年小鼠的感染模型，有望解決上述問題。

中國大陸地區手足口病疫情的病源主要是C4亞型毒株，但是，該亞型的毒株對于實驗動物普遍敏感性不高，導致目前尚未見可以使被感染動物發病，甚至死亡的模型報道。進一步提高病毒對動物的噬性，或改善動物對病毒的敏感性，有望解決這一問題。

［1］Schmidt NJ，Lennette EH，Ho HH.An apparently new enterovirus isolated from patients with disease of the central nervous system［J］.J Infect Dis，1974，129:304－309.

［2］Ho M.Enterovirus 71:the virus，its infections and outbreaks［J］.J Microbiol Immunol Infect，2000，33:205－216.

［3］Chang LY，Huang LM，Gau SS，et al.Neurodevelopment and cognition in children after enterovirus 71 infection［J］.N Engl J Med，2007，356:1226－1234.

［4］Abubakar S，Chee HY，Shafee N，et al.Molecular detection of enteroviruses from an outbreak of hand，foot and mouth disease in Malaysia in 1997［J］.Scand J Infect Dis，1999，31:331－335.

［5］Ortner B，Huang CW，Schmid D，et al.Epidemiology of enterovirus types causing neurological disease in Austria 1999－2007:detection of clusters of echovirus 30 and enterovirus 71 and analysis of prevalent genotypes［J］.J Med Virol，2009，81:317－324.

［6］Huang YP，Lin TL，Kuo CY，et al.The circulation of subgenogroups B5 and C5 of enterovirus 71 in Taiwan from 2006 to 2007［J］.Virus Res，2008，137:206－212.

［7］Li L，He Y，Yang H，et al.Genetic characteristics of human enterovirus 71 and coxsackievirus A16 circulating from 1999 to 2004 in Shenzhen，People＇s Republic of China［J］.J Clin Microbiol，2005，43:3835－3839.

［8］Shih SR，Ho MS，Lin KH，et al.Genetic analysis of enterovirus 71 isolated from fatal and non－fatal cases of hand，foot and mouth disease during an epidemic in Taiwan，1998［J］.Virus Res，2000，68:127－136.

［9］李仁清，陳麗娟，王玉梅，等.北京地區2006－2008年腸道病毒71型VP1區基因特征分析［J］.中華流行病學雜志，2009，30:45－49.

［10］Chumakov M，Voroshilova M，Shindarov L，et al.Enterovirus 71 isolated from cases of epidemic poliomyelitis－like disease in Bulgaria［J］.Arch Virol，1979，60:329－340.

［11］Arita M，Ami Y，Wakita T，et al.Cooperative effect of the attenuation determinants derived from poliovirus sabin 1 strain is essential for attenuation of enterovirus 71 in the NOD/SCID mouse infection model［J］.J Virol，2008，82:1787－1797.

［12］Chua BH，Phuektes P，Sanders SA，et al.The molecular basis of mouse adaptation by human enterovirus 71［J］.J Gen Virol，2008，89:1622－1632.

［13］Chan YF，AbuBakar S.Human enterovirus 71 subgenotype B3 lacks coxsackievirus A16－like neurovirulence in mice infection［J］.Virol J，2005，2:74.

［14］Chen YC，Yu CK，Wang YF，et al.A murine oral enterovirus 71 infection model with central nervous system involvement［J］. J Gen Virol，2004，85:69－77.

［15］Wang YF，Chou CT，Lei HY，et al.A mouse－adapted enterovirus 71 strain causes neurological disease in mice after oral infection［J］.J Virol，2004，78:7916－7924.

［16］Ong KC，Badmanathan M，Devi S，et al.Pathologic characterization of a murine model of human enterovirus 71 encephalomyelitis［J］.J Neuropathol Exp Neurol，2008，67: 532－542.

［17］Wu CN，Lin YC，Fann C，et al.Protection against lethal enterovirus 71 infection in newborn mice by passive immunization with subunit VP1 vaccines and inactivated virus［J］.Vaccine，2001，20:895－904.

［18］朵建英，王衛，佟薇，等.腸道病毒71型(EV71)對ICR小鼠的感染［J］.中國比較醫學雜志，2009，5:41－46.

［19］Nagata N，Shimizu H，Ami Y，et al.Pyramidal and extrapyramidal involvement in experimental infection of cynomolgus monkeys with enterovirus 71［J］.J Med Virol，2002，67:207－216.

［20］Nagata N，Iwasaki T，Ami Y，et al.Differential localization of neurons susceptible to enterovirus 71 and poliovirus type 1 in the central nervous system of cynomolgus monkeys after intravenous inoculation［J］.J Gen Virol，2004，85:2981－2989.

［21］Arita M，Shimizu H，Nagata N，et al.Temperature－sensitive mutants of enterovirus 71 show attenuation in cynomolgus monkeys［J］.J Gen Virol，2005，86:1391－1401.

［22］Chen CS，Yao YC，Lin SC，et al.Retrograde axonal transport:a major transmission route of enterovirus 71 in mice［J］.J Virol，2007，81:8996－9003.

［23］Wang SM，Lei HY，Yu CK，et al.Acute chemokine response in the blood and cerebrospinal fluid of children with enterovirus 71－associated brainstem encephalitis［J］.J Infect Dis，2008，198:1002－1006.

［24］Hashimoto I，Hagiwara A，Kodama H.Neurovirulence in cynomolgus monkeys of enterovirus 71 isolated from a patient with hand，foot and mouth disease［J］.Arch Virol，1978，56:257－261.

［25］Chun SJ，Liu JN，Li WB，et al.The cross－reactivity of the enterovirus 71 to human brain tissue and identification of the cross－reactivity related fragments［J］.Virology J，2010，7(1): 47.

［26］Arita M，Nagata N，Iwata N，et al.An attenuated strain of enterovirus 71 belonging to genotype A showed a broad spectrum of antigenecity with attenuated neurovirulence in cynomolgus monkeys［J］.J Virol，2007，81(17):9386－9395.

［27］Chung YC，Ho MS，Wu JC，et al.Immunization with virus－like particles of enterovirus 71 elicits potent immune response and protects m ice against lethal challenge［J］.Vaccine，2008，26: 1855－1862.

［28］Ong KC，Devi S，Cardosa MJ，et al.Formaldehyde－inactivated whole－virus vaccine protects a murine model of enterovirus 71 encephalomyelitis against disease［J］.J Virol，84:661－665.

［29］Li ZH，Li CM，Ling P，et al.Ribavirin reduces mortality in enterovirus 71－infected mice by decreasing viral replication［J］. J Infect Dis，2008，197:854－857.

［30］Liu ML，Lee YP，Wang YF，et al.Type I interferons protect mice against enterovirus 71 infection［J］.J Gen Virol，2005，86:3263－3269.

［31］Weng TY，Chen LC，Shyu HW，et al.Lactoferrin inhibits enterovirus 71 infection by binding to VP1 protein and host cells［J］.Antiviral Res，2005，67:31－37.

Hum an Enterovirus 71 Infection in Experim ental anim als

LIU Jiang－ning1，ZHANG Lian－feng1，2

(1.Key Laboratory of Human Diseases Comparative Medicine，Ministry of Health;Institute of Laboratory Animal Science，Chinese Academy of Medical Sciences(CAMS)＆Comparative Medicine Centre，Peking Union Medical Collage(PUMC)，Beijing 100021，China;2.Key Laboratory of Human Diseases Animal Models，State administration of Traditional Chinese Medicine;Institute of Laboratory Animal Science，CAMS＆Comparative Medicine Centre，PUMC，Beijing 100021)

Human enterovirus 71(EV71)is one of the major pathogens causing hand，foot and mouth disease in children.The serious complications can lead to neurological symptoms and even death.EV71 is one of the factors threatening the health of Chinese children recently.However，there is currently no vaccine available to prevent clinical infection of this virus.As anim l models are the foundation for pathogenesis studies，vaccine and drug research on EV71 infection，in this paper，two commonly used animal model for EV71，mouse and rhesus monkey，are described and their applications in research are summarized.，to provide fundamentall information for researchers in selection of a suitable animal model.

Human Enterovirus 71;Hand，foot and mouth disease;Model，animal

R－322

A

1005－4847(2010)03－S5－05

2010－04－14

十一五傳染病專項支持(2009ZX10004－402)。

劉江寧(1981－)，助理研究員，研究方向:傳染病的動物模型。E－mail:ljn_zb03038@126.com

張連峰。E－mail:Zhanglf@cnilas.org