Dex疫苗的研究現狀及其在自身免疫性疾病的應用①

尹煒凡 綜述 楊 歡 審校 (中南大學湘雅醫院神經內科,長沙 410011)

外泌體是由活細胞分泌的直徑為60～90 nm的囊狀小體,在電鏡下為脂質雙層膜包圍的扁平球體,呈特征性的杯狀外型,存在于血清、尿液、唾液、乳汁等體液中[1]。作為一種亞細胞結構,它能代表其來源細胞行使一系列生物學功能,如腫瘤細胞來源的外泌體能介導免疫逃逸,腸上皮細胞來源的外泌體參與了口服耐受作用的發揮,胎盤絨毛膜上皮細胞來源的外泌體能介導母胎耐受等等。近年來,樹突狀細胞(DC)來源的外泌體(Dex)引起了人們廣泛的關注,因其即能誘導機體抗腫瘤,抗弓形蟲等病原體的強烈的適應性免疫應答,又能在一定條件下誘導抗原特異性的免疫耐受,在介導抗腫瘤免疫、移植免疫耐受方面顯示了巨大的應用前景。近年來其在自身免疫性疾病治療中的應用也逐漸引起關注,本文就Dex疫苗的研究現狀以及Dex在自身免疫性疾病的臨床應用作一簡要綜述。

1 Dex疫苗的研究現狀

1.1 Dex疫苗的體內作用機制 應用熒光示蹤,可以發現Dex在體內的遷移途徑。將髓源Dex真皮內或皮下注射入小鼠體內,在注射部位Dex即能被位于皮膚的未成熟DC捕獲,其表面表達的分子被未成熟DC吸收,24小時后DC和Dex復合物則遷移至相應的引流淋巴結區,引起相應的免疫應答或者誘導抗原特異性的免疫耐受[2]。

目前Dex在體內具體的作用機制尚不清楚,研究發現,Dex疫苗在體內產生的免疫效應與Dex表面分子和機體的內環境有關。成熟樹突狀細胞來源外泌體(mature dendritic cell derived exosome,mDex)表面高表達MHC Ⅱ 、CD40、CD80、CD86共刺激分子,在相應的淋巴結引流區,mDex能與DC和T細胞相互作用,使初始T細胞活化為抗原特異性T細胞,誘導強烈的適應性免疫應答。而非成熟樹突狀細胞來源的外泌體(immature dendritic cell derived exosome,imDex)表面低表達 MHC Ⅱ、CD40、CD80、CD86 共刺激分子,在與引流區淋巴結T細胞相互作用時不能活化T細胞,導致T細胞無能或低能反應,從而誘導免疫耐受。在小鼠心臟移植的實驗中發現,預先用imDex處理受者,移植手術后受者體內CD4+細胞顯著減少,且移植物中浸潤的白細胞減少,IFN-gama mRNA的表達明顯下降[3]。應用基因工程技術使樹突狀細胞表面表達FasL、IL-4、IL-10等分子來源的外泌體(即 Dex-FasL、Dex-IL-4、Dex-IL-10)能啟動 T 細胞內的免疫抑制信號,誘導T細胞凋亡,產生免疫耐受效應。研究發現,Dex-IL-4、Dex-IL-10和 Dex-FasL表面表達較高濃度的FasL,它們利用Fas/FasL途徑誘導T細胞凋亡,產生免疫耐受效應[2,4,5]。機體的內環境主要指的是DC的成熟狀態,研究發現DC的成熟狀態對于Dex疫苗效應的發揮起重要作用。在無DC或未成熟DC存在的條件下,mDex或imDex均不能有效激活T細胞,而應用促DC成熟因子(LPS、TNF-α、CpG、CD40L)后,mDex或 imDex在體內能不同程度的激活T細胞[6]。

1.2 Dex疫苗的應用途徑 研究證明,通過真皮內注射的Dex能刺激引流淋巴結區3.8%的淋巴細胞增殖,而皮下注射的Dex僅能引起 0.9%的淋巴細胞增殖,表明通過真皮內注射的 Dex能夠影響的淋巴細胞數是皮下注射的4倍[7]。因此,我們不難推斷,要想在免疫增強或者免疫耐受中取得較大效果,應該采用真皮內注射,而非皮下注射的方式。然而,上述兩種途徑與靜脈注射的途徑相比,哪種更能影響淋巴細胞尚無報道,有待進一步研究。

1.3 Dex疫苗的特點 mDex疫苗已經應用于治療黑色素瘤和非小細胞肺癌的1期臨床試驗,顯示了巨大的應用前景。與傳統的DC疫苗相比,Dex疫苗安全穩定具有以下優點:①非細胞性,可以冷凍儲藏,在冰凍狀態下儲存幾個月,活性不會受影響。②Dex疫苗注入體內后其表面分子不會像DC那樣經歷表型變化,而且其在體內發揮作用不受CTL細胞的影響[8]。③Dex疫苗的副作用輕微且可耐受。在進展性非小細胞肺癌的臨床試驗中,9名Ⅲ～Ⅳ期非小細胞肺癌患者在實驗前接受了Dex介導的遲發型超敏反應的觀察。研究發現,3名患者48小時后的皮膚測驗結果顯示陽性。其中,2名患者有5 mm的硬結和紅斑,1名患者有6 mm的硬結和紅斑。整個實驗結束后的副反應觀察發現8名患者有注射部位的紅斑、硬結和腫脹。1名患者有流感樣癥狀,1名患者有手臂的外周性水腫[9]。④Dex疫苗具有抗原特異性。利用exosome display技術將可溶性抗原負載至Dex上,可以產生抗原特異性 Dex[10]。該種Dex用于小鼠體內能產生特異性的免疫應答或免疫抑制效應。

1.4 Dex疫苗在抗腫瘤治療的應用 鑒于負載腫瘤抗原肽的Dex在體內能引發CD4+或CD8+T細胞介導的抗原特異性的免疫應答以及能夠按照GMP標準成功地制備人單核細胞源DC來源的Dex。目前Dex在抗腫瘤方面應用的研究廣泛開展。在惡性程度極高的黑色素瘤的治療中,給15例表達MAGE2的黑色素瘤患者每周四次的皮下或者靜脈注射冰凍保存的負載MAGE2抗原肽的Dex,連續使用四周,劑量逐步增加,對于病情穩定者和腫瘤消退者再每3周注射一次,結果發現間接負載處理的Dex使1例患者病情得到穩定,并接受了后續的每3周注射1次,共8次的治療,患者病情得到了長期控制。間接負載處理的Dex使1例患者皮下腫瘤消退,但是發生了肺轉移[11]。在Ⅲ、Ⅳ期非小細胞肺癌即進展性非小細胞肺癌的臨床試驗中,入組的病人有9例,在為期兩年的隨訪觀察中2例病人的病情穩定時間超過了12個月[9]。上述研究使我們看到了Dex在臨床抗腫瘤治療中的巨大應用前景,然而要想讓Dex疫苗發揮更好的抗腫瘤效果,Dex的結構、體內應用的方式方法以及最適劑量方面有待進一步研究。

1.5 Dex在移植免疫耐受方面的應用 髓源imDex和調節樹突狀細胞來源外泌體(regulatory dendritic cell derived exosomes,rDex)均能夠誘導宿主的移植免疫耐受。Pêche等[12,13]先后證實了在小鼠心臟移植手術中,髓源imDex能調節受者的抗移植免疫反應,并能顯著延長同種異體心臟的存活時間。劉袁媛等[14]在小鼠皮膚移植試驗中觀察到 rDex比 imDex能產生更好的移植免疫耐受效應。上述動物實驗預示著Dex將會是抗移植排斥反應的新方法。

2 Dex在自身免疫性疾病治療中的應用

目前,Dex在自身免疫性疾病治療方面的應用主要是在對風濕性關節炎治療的觀察上。風濕性關節炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一種以關節滑膜炎為特征的慢性全身性自身免疫性疾病。實驗觀察所應用的研究模型為遲發型超敏反應模型。研究發現,imDex以及通過基因工程技術使髓源DC表面表達IL-4、IL-10、FasL來源的Dex均能產生抑制遲發型超敏反應的作用。盡管其具體作用機制尚不十分明確,但是上述實驗研究能夠為將抑制性Dex用于其它自身免疫性疾病治療的研究奠定了基礎。

過表達吲哚胺2,3-雙加氧酶(indoleamine 2,3-dioxygenase,IDO)和細胞毒性T淋巴細胞相關抗原 4融合蛋白(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4 immunoglobulin,CTLA-4Ig)的髓源DC來源的外泌體(IDO/Dex和CTLA-4Ig/Dex),能夠抑制小鼠遲發型超敏反應的炎癥進展,阻止類風濕性關節炎的病情進展。IDO是近來研究較多的一種免疫調節蛋白,能夠維持外周耐受,在妊娠、腫瘤、自身免疫性疾病和移植耐受方面起著重要作用。IDO能降低T細胞中色氨酸的含量,利用產生細胞毒性代謝產物,即犬尿氨酸,影響T細胞的活性。CTLA-4Ig是 IDO的誘導物,通過DC表面B7分子能誘導DC表達IDO。研究發現,IDO/Dex本身并不含有 IDO蛋白,它們能產生免疫耐受的可能機制是傳遞功能性的IDO蛋白給DC或者T細胞[15]。

2.1 體外預實驗 首先,通過基因工程技術使表面表達細胞因子IL-10的髓源DC分泌外泌體,即重組IL-10(r-IL-10)處理過的或含IL-10重組腺病毒載體感染(v-IL-10)的骨髓來源的Dex(r-IL-10/Dex和v-IL-10/Dex),在將其應用于于小鼠體內試驗之前先檢驗了其是否具備抑制T細胞活性的功能。將vIL-10/Dex、未轉染 IL-10的普通髓源 Dex和 rIL-10/Dex分別加入混合淋巴細胞液中,5天后觀察其中的T細胞增殖情況。結果發現,vIL-10/DC能完全抑制T細胞增殖,未轉染IL-10的普通髓源DC的抑制作用很少或者基本沒有,而rIL-10/Dex具有中等的抑制效果[4]。該實驗不僅證實了IL-10/Dex的免疫抑制效應,而且比較了三種Dex的免疫抑制效應,顯示了通過病毒轉染的IL-10/Dex的免疫抑制效應更強,為IL-10/Dex及其他抑制性Dex的體內應用奠定了基礎。

2.2 體內試驗的應用 在小鼠遲發型超敏反應模型中,分別比較vIL-10/Dex、vIL-10/DC和生理鹽水抑制遲發型超敏反應的能力。分別將vIL-10/Dex、vIL-10/DC和生理鹽水注入小鼠一側的后足墊真皮內,對側注入等劑量的生理鹽水,分別在24、48和72小時后觀察雙側足的腫脹情況,并用宏觀評分系統進行記錄。結果顯示和生理鹽水組相比vIL-10/DC組注射足的足墊腫脹情況減輕了大于50%,對側腫脹情況減輕了40%。vIL-10/Dex組雙側足墊腫脹情況減輕了65%。在膠原性關節炎的模型中,在小鼠被抗原免疫后的第28天,靜脈注射vIL-10/Dex和等劑量的生理鹽水對照,結果注射vIL-10/Dex組不僅膠原性關節炎的發生日期推遲了,疾病的嚴重程度亦降低了。而生理鹽水組的膠原性關節炎則按往常一樣進展。同樣的,將通過基因工程技術使表面表達IL-4或FasL的髓源DC來源的Dex,即IL-4/Dex或FasL/Dex,真皮內注入小鼠一側后足墊,亦能減輕小鼠足關節的遲發型超敏反應,當靜脈注射上述Dex時能夠推遲膠原性關節炎的發生時間以及減弱其炎癥反應的程度。盡管Dex誘導免疫耐受的具體作用機制尚不明確,但是Kim[2]對 Dex進行熒光標記示蹤發現,在注入真皮內的48小時后,在真皮中能檢測到Dex和CD11c+細胞的復合物,在同側窩的淋巴結引流區該復合物亦被檢測到,而在對側淋巴結引流區、肝臟和脾臟中則未被發現。這似乎不能解釋對側關節的免疫抑制現象。對于靜脈注射的Dex而言,24小時后檢測到Dex在肝臟中被F4/80-(大部分為CD11c+)細胞所捕獲,在脾臟中則被F4/80+脾巨噬細胞所捕獲。將用IL-4/Dex致耐受的小鼠遲發型超敏反應模型中的CD11c+分離出來,在將其注入同基因系的被抗原致敏的小鼠體內,亦能減輕遲發型超敏反應的炎癥程度。這不禁使我們聯想到,Dex在真皮內注入后,和同側淋巴結區的CD11c+細胞作用將自身所攜帶的致免疫耐受分子傳遞給CD11c+,由CD11C+行使抑制抗原特異性免疫耐受的作用。而靜脈注射的Dex則循環至肝脾區,被F4/80+脾巨噬細胞和肝臟 F4/80-細胞捕獲,傳遞免疫抑制性分子后,由F4/80+脾巨噬細胞和肝臟F4/80-細胞行使免疫抑制功能。進一步的致免疫耐受機制尚不清楚,有待于進一步研究。

2.3 Dex免疫抑制效應發揮的幾個關鍵問題 要想發揮Dex的免疫抑制功能,并將其成功地應用于自身免疫性疾病的動物模型和臨床試驗,有幾個關鍵的問題不容忽視。

2.3.1 外泌體的完整性 外泌體膜是否完整對于其免疫抑制效應的發揮起著至關重要的作用。Kim等[2]發現在小鼠的遲發型超敏反應模型中,經過四輪的冰凍-解凍處理后的髓源Dex/vIL-10或Dex/rIL-10不再具備抑制關節炎炎癥反應的作用,電鏡觀察到經過四輪的冰凍-解凍后,Dex表面雙層膜不再完整,并且在Dex碎片中Hsc70已經檢測不到了,而已知的Hsc70是體內誘導T細胞耐受的重要分子。同樣的,通過聲裂解處理的Dex表面膜裂解,亦不能發揮其免疫抑制效應。

2.3.2 免疫抑制效應的發揮所依耐的分子 Dex免疫抑制效應的發揮與其表面分子相關。首先,供者Dex必須和受者來源于同一基因型,Dex免疫效應的發揮具有MHC依賴性。其次,給Dex負載一定抗原肽產生的免疫耐受效應是針對特定抗原,對其它抗原則不起作用。另外,根據前述,IL-4/Dex、IL-10/Dex和FasL/Dex能夠產生對類風濕性關節炎的炎癥抑制作用與其表面表達FasL有關。在IDO試驗中,IDO/Dex和CTLA-4Ig/Dex作為媒介傳遞功能性的IDO蛋白,其抑制效應的發揮必須有B7分子的參與。

3 問題與展望

Dex在動物實驗和臨床試驗的應用研究提示,Dex在抗腫瘤免疫和誘導移植耐受有巨大應用前景。然而,對于Dex的具體體內作用機制,以及作為亞細胞結構的生物性疫苗,如何使其功能發揮最大的作用以及如何最大限度降低其副作用仍需要進一步研究。

近年來,Dex在治療自身免疫性疾病的研究陸續開展,在風濕性關節炎模型中,我們看到了IL-4/Dex、IL-10/Dex、FasL/Dex、IDO/Dex 和 CTLA-4Ig/Dex對風濕性關節炎炎癥反應的抑制作用,這為我們將抑制性Dex應用于自身免疫性疾病奠定了基礎。然而各種Dex的具體作用機制尚未完全明了,需要進一步研究。為將Dex應用于臨床,我們必須找到一種免疫抑制效應最強的Dex,故我們尚須比較等劑量的上述四種Dex和imDex或者其它抑制性Dex免疫抑制效應的程度、起效時間和作用持續時間等方面有無差異。另外,Dex的免疫效應的發揮與其劑量是否有關、是呈何種關系以及如何調控其劑量以取得最大的免疫抑制效亦尚須進一步研究。

1 Stoorvogel W,Kleijmeer M J,Geuze H J et al.The biogenesis and functions of exosomes[J].Traffic,2002;3(5):321-303.

2 Kim S H,Bianco N,Shufesky W et al.Effective treatment of inflammatory disease models with exosomes derived from dendritic cells genetically modified to express IL-4[J].J Immunol,2007;179:2242-2249.

3 Pêche H,Renaudin K,Beriou G et al.Induction of tolerance by exosome and short-term immunosuppression in a fully MHC-mismatched rat cardiac allograft model[J].Am J Transplantat,2006;6(7):1541-1550.

4 Kim S H,Lechman E R,Bianco N et al.Exosome derived from IL-10-treated dendritic cells can suppress inflammation and collagen-induced arthritis[J].J Immunol,2005;174(10):6440-6448.

5 Kim S H,Bianco N,Menon R et al.Exosome derived from genetically modified DC expressing FasL are anti-inflammatory and immunosuppressive[J].Mol Ther,2006;13(2):289-300.

6 任亞娜,范華驊,聶曉絢 et al.樹突狀細胞外泌體免疫作用機制的初步研究[J].中國實驗血液學雜志,2008;16(3):650-654.

7 Hao S,Ye Z,Yang J et al.Intradermal vaccination of dendritic cell derived exosomes is superior to a subcutaneous one in the induction of antitumor immunity[J].Cancer Biother Radiopharm,2006;21(2):146-154.

8 Luketic L,Delanghe J,Paul T Sobol et al.Antigen presentation by exosomes released from peptide-pulsed dendritic cells Is not suppressed by the presence of active CTL[J].J Immunol,2007;179:5024-5032.

9 Morse M A,Garst J,Osada T et al.A phase I study of dexosome immunotherapy in patients with advanced non-small cell lung cancer[J].J Transl Med,2005;3:9-11.

10 Delcayre A,Estelles A,Sperinde J et al.Exosome diplay technology:applications to the development of new diagnostics and therapeutics[J].Blood Cells Mol Dis,2005;35(2):158-168.

11 Chaput N,Taieb J,Schartz N E et al.Exosome based immunotherapy[J].Cancer Immunol Immunother,2004;53:234-239.

12 Pêche H,Heslan M,Usal C et al.Presentation of donor majorhistocompatibility complex antigens by bone marrow dendritic cell-derived exosomes modulates allograft rejection[J].Transplantat,2003;76:1503-1510.

13 Pê che H,RenaudinK,Beriou G et al.Induction of tolerance by exosome and short-term immunosuppression in a fully MHC-mismatched rat cardiac allograft model[J].Am J Transplantat,2006;6(7):1541-1550.

14 劉袁媛,范華驊,任亞娜 et al.小鼠調節性樹突狀細胞分泌的外泌體誘導免疫耐受的實驗研究[J].中國實驗血液學雜志,2008;16(2):406-410.

15 Bianco N,Kim S H,Ruffner M A et al.Therapeutic effect of exosomes from Indoleamine 2,3-Dioxygenase Positive dendritic cells in collageninduced arthritis and delayed-type hypersensitivity disease models[J].Arthritis Rheum,2009;60(2):380-389.