短發夾狀RNA基因沉默補體受體C5aR及抑制LPS誘導的腎臟上皮細胞凋亡①

陳 棟 張 艷李 明 尹注增 陳 剛 張偉杰 陳 實 (華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院器官移植研究所 教育部/衛生部器官移植重點實驗室,武漢430030)

·移植免疫學·

短發夾狀RNA基因沉默補體受體C5aR及抑制LPS誘導的腎臟上皮細胞凋亡①

陳 棟 張 艷②③李 明 尹注增 陳 剛 張偉杰 陳 實 (華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院器官移植研究所 教育部/衛生部器官移植重點實驗室,武漢430030)

目的:探討短發夾狀RNA基因沉默補體受體C5aR及抑制LPS誘導的腎臟上皮細胞凋亡的作用效果。方法:構建針對大鼠補體受體C5aR基因編碼區的短發夾狀RNA(shRNA)真核表達載體質粒pRNAT-U6.1-C5aR shRNA,采用電穿孔的方法轉染RK3E細胞,經G418篩選后,形成穩定的表達C5aR shRNA的細胞系。實驗分為3組,①正常對照組:未轉染的RK3E細胞;②陰性對照組:轉染空載體pRNAT-U6.1的RK3E細胞系;③實驗組:轉染C5aR shRNA的RK3E細胞系。經脂多糖(LPS)孵育12小時后,流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率,RT-PCR檢測mRNA的表達,γ計數儀測定125I標記的C5a與RK3E的結合情況。結果:與正常對照組和陰性對照組相比,實驗組的細胞凋亡率顯著降低(P<0.01),C5aR mRNA水平顯著降低(P< 0.01),125I標記的C5a與RK3E結合活性顯著下降。結論:針對C5aR的特異性短發夾RNA可以明顯引起靶基因的沉默,進而抑制LPS誘導的腎臟上皮細胞凋亡的發生。

RNA干擾;C5aR;基因沉默;凋亡

腎臟上皮細胞凋亡是急性腎功能衰竭等病理生理過程的重要機制之一,細胞凋亡的發生與補體系統的激活有關,其中C5aR是補體系統的重要組成部分,表達于腎臟上皮細胞表面,參與補體系統的激活并介導靶細胞的凋亡[1]。RNA干擾(RNAi)是近年來發現的一種高效、特異性阻斷mRNA表達而導致轉錄后基因沉默的現象,從而不能表達相應的特異性蛋白質,最終影響其生物學功能。這一干擾過程是由與目的基因有序列同源性的雙鏈RNA引起的。在哺乳動物中發現21～23核苷酸(nt)的雙鏈RNA介導的RNAi現象,開啟了應用siRNA(Small interfering RNA)的治療應用之門[2,3]。在本研究中,我們構建了針對大鼠C5aR特異性的發卡結構的RNAi質粒表達載體,并轉染大鼠腎臟上皮細胞RK3E,建立穩定的轉染細胞系,研究其基因沉默及抑制LPS誘導細胞凋亡的作用效果,為進一步研究如何減輕急性腎功能衰竭等病理過程奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 RNAi表達載體 pRNAT-U6.1/Neo siRNA表達載體購自美國Genescript公司。

1.1.2 細胞系 大鼠腎臟上皮細胞RK3E細胞由華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院器官移植研究所保存。

1.1.3 試劑 DMEM培養基購自Sigma公司,胎牛血清購自Sigma公司,LB培養基為Promega公司產品,Trizol試劑購自Stratagene公司,C5aR的擴增引物由Invitrogen公司合成。

1.2 方法

1.2.1 C5aR基因shRNA的設計及載體構建 選用pRNAT-U6.1/Neo siRNA表達載體作為空載體,其攜帶有cGFP和U6的啟動子,可以表達形成shRNA。根據GenBank提供的大鼠C5aR基因序列,使用美國Ambion公司在線設計軟件,通過基因序列比對,挑選出一條長為21個堿基的特異性寡核苷酸序列(5′-TG AAACTCTTGCTGTCCCTGC-3′),合成C5aR基因的發夾樣兩端配對的 siRNA寡核苷酸(Small hairpin RNA)(5′-G ATCCCGTG AAACTCTTGC TGTCCCTGCTTG ATATCCGGCAGGG ACAGCAAG AGTTTCATTTTTTCCAA A-3′),同時合成互補鏈5′-AGCTTTTGG AAAAAATG A AACTCTTGCTGTCCCTGCTCTCTTG AAGCAGGG ACAGC AAG AGTTTCACGG-3′),shRNA的寡核苷酸序列包括靶序列的正義鏈、反義鏈和環形區域。經退火形成互補雙鏈,用于連接pRNAT-U6.1載體。

HindⅢ和BamHⅠ雙酶切RNAT-U6.1空載體成線性,T4連接酶將攜帶有C5aR特異性的RNAi核苷酸序列的互補雙鏈連接進入表達載體,然后轉化大腸桿菌DH5α,挑取單克隆菌落,小量擴增,收集菌液,使用DNA小量提取試劑盒提取質粒,經測序正確后,采用氯化銫離心法大量提取質粒。

1.2.2 細胞培養 大鼠RK3E細胞用含10%胎牛血清的DMEM培養基在5%CO2、37℃下培養傳代,接種于75 cm2的細胞培養瓶。

1.2.3 細胞轉染 采用電穿孔的方法進行細胞轉染。收集RK3E細胞,2×106個細胞混合40μg的shRNA,在170 V,25 ms的條件下,應用Bio-Rad電穿孔儀進行電穿孔,熒光顯微鏡下可見轉染的RK3E細胞呈綠色熒光,經過G418篩選,形成穩定的攜帶C5aR shRNA的RK3E細胞系。

1.2.4 脂多糖(LPS)誘導RK3E細胞凋亡率的檢測

實驗分為3組:(1)正常對照組:為正常的RK3E細胞;(2)陰性對照組:轉染空載體pRNAT-U6.1的RK3E細胞系;(3)實驗組:轉染 C5aR shRNA的RK3E細胞。

分別將上述3組細胞接種于六孔板中。分別加入LPS 100 ng/ml誘導RK3E細胞凋亡。LPS孵育12小時后收集細胞,磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌,調整細胞濃度為1×106ml-1,70%冷乙醇固定,-20℃過夜。檢測前PBS洗滌1次,加入含RNA酶(終濃度為0.25 mg/ml)的碘化丙啶(終濃度為50μg/ml)染色液,室溫孵育30分鐘,用流式細胞儀(美國FACSort-BD公司產品,使用CellQuest軟件)檢測細胞凋亡率。

1.2.5 半定量RT-PCR檢測RK3E細胞C5aR的表達 經LPS刺激后,收集上述3組細胞,用Trizol試劑提取細胞總RNA,用3μg RNA合成cDNA。PCR條件:95℃5分鐘,94℃30秒,58℃30秒,72℃30秒,30個循環,72℃延伸10分鐘。C5aR引物:上游引物為5′-GG ACCCCATAAGTAACG ACAGC-3′,下游引物為5′-CCACACCACCAGGGCATTTC-3′;內參照磷酸甘油醛脫氫酶(G APDH)引物:上游引物為5′-TG ATG ACATCAAG AAGGTGGTG AA-3′,下游引物為5′-TCCTTGG AGGCCATGTAGGCCAT-3′,PCR產物經1.5%的瓊脂糖凝膠電泳分析。使用Chemilmager 5500軟件進行圖像分析,測出擴增產物條帶的吸光度(A)值,并與同一樣本G APDH的A值進行比值定量分析,以此比值表示C5aR mRNA的相對含量。

1.2.6125I-rrC5a與RK3E的結合試驗 上述3組細胞接種于六孔板,并置于0℃冰上,用2 ml Hanks液孵育0.5小時,PBS液洗滌2次后,RK3E細胞與125I標記的重組大鼠C5a(rrC5a)的PBS緩沖液(0.1%的胎牛血清)孵育20分鐘,隨后用PBS液洗滌4次后, 1%SDS裂解RK3E細胞,0.1%乙基苯基聚乙二醇洗滌后,采用γ計數儀測定125I標記的C5a與RK3E的結合情況,數值用cpm值表示。

2 結果

2.1 成功構建針對大鼠C5aR的shRNA表達載體pRNAT-U6.1-C5aR shRNA HindⅢ和BamHⅠ雙酶切pRNAT-U6.1空載體成線性,T4連接酶將攜帶有C5aR特異性的RNAi核苷酸序列的互補雙鏈連接進入表達載體,經測序鑒定,證明我們設計的寡核苷酸序列已經成功退火,并連接至pRNAT-U6.1。

2.2 C5aR shRNA轉染的RK3E穩定細胞系 電穿孔的方法將C5aR shRNA轉染 RK3E細胞,由于pRNAT-U6.1攜帶有cGFP基因,可以表達綠色熒光蛋白,因此,轉染的RK3E細胞顯示綠色熒光,經G418篩選,形成穩定表達C5aR shRNA的細胞系,該細胞系在熒光顯微鏡下可見遍布視野的綠色熒光,而未轉染的RK3E細胞無綠色熒光,只見黑色背景視野(見圖1和圖2)。

2.3 LPS誘導的RK3E細胞凋亡率 流式細胞儀檢測結果顯示,在LPS的刺激12小時后,轉染C5aR shRNA的RK3E細胞凋亡率為24.81%±2.87%,而未轉染的RK3E細胞和轉染空載體pRNAT-U6.1的RK3E細胞凋亡率分別為 78.32%±3.62%和76.46%±5.54%,與未轉染的RK3E細胞和轉染空載體pRNAT-U6.1的RK3E細胞相比,轉染C5aR shRNA的RK3E的細胞凋亡率顯著下降,差異均有顯著的統計學意義(P<0.01)。見圖3。

圖1 未轉染的RK3E細胞Fig.1 Untransfected RK3E cells

圖2 C5aR shRNA轉染RK3E細胞Fig.2 C5aR shRNA transfected RK3E cells

2.4 C5aR mRNA水平的表達 LPS刺激12小時后,收集3組細胞,進行RT-PCR檢測mRNA水平的表達,結果顯示:經LPS刺激后,轉染C5aR shRNA的RK3E細胞的mRNA相對含量為26.11%±3.16%,而未轉染的RK3E細胞和轉染空載體pRNAT-U6.1的RK3E細胞中mRNA相對含量為98.74%±2.27%和105.21%±2.57%。與未轉染的RK3E細胞和轉染空載體pRNAT-U6.1的 RK3E細胞相比,轉染C5aR shRNA的RK3E細胞mRNA表達水平顯著降低,差異均具有統計學意義(P<0.01),見圖4A、B。

2.5 各組RK3E細胞125I-rrC5a的結合活性 LPS刺激的條件下測定各組RK3E細胞中C5a的結合活性,結果顯示:與正常對照組和陰性對照組相比,經LPS刺激后,125I-rrC5a與轉染C5aR shRNA的RK3E細胞的結合活性顯著降低(P<0.05),見圖5。

圖3 LPS刺激后RK3E細胞凋亡率Fig.3 Apoptosis rate of RK3Eafter LPS stimulated

圖4 LPS刺激12小時后,RT-PCR檢測各組C5aR mRNA的表達(A,B)Fig.4 12 h after LPS stimulated,C5aR mRNA was detected by RT-PCR in different group(A,B)

圖5 LPS刺激條件下125I-rrC5a與RK3E細胞的結合活性Fig.5 Binding of125I-rrC5a to RK3E stimulated with LPS

3 討論

補體活化參與缺血再灌注損傷等眾多病理生理過程,是關聯先天免疫和獲得性免疫的重要紐帶。腎臟上皮細胞表達眾多的補體受體C5aR,在腎臟上皮細胞的損傷和細胞凋亡的執行過程中起關鍵作用[1,4,5]。因此,本研究中我們設計了針對大鼠補體受體C5aR作為抑制細胞凋亡的靶位點,進而探討通過短發夾狀RNA基因沉默C5aR及抑制LPS誘導的腎臟上皮細胞的凋亡的作用。

在多種生物體細胞中,外源或內源性雙鏈RNA (Double-stranded RNA,dsRNA)可觸發細胞內同源mRNA的特異性降解,從而使該基因表達沉默,這種現象稱為RNA干擾(RNA interference,RNAi)。RNAi屬于轉錄后水平的基因沉默機制,具有高度的序列特異性和抑制基因表達的高效性[6,7]。在本研究中我們根據大鼠C5aR的基因序列,設計發夾樣兩端配對的shRNA寡核苷酸,并連接到真核表達載體pRNAT-U6.1,構建形成發夾狀siRNA的質粒(shRNA)表達載體。然后進行電穿孔的方法轉染腎臟上皮細胞RK3E,經G418篩選后得到穩定的轉染細胞系,在熒光顯微鏡下可見遍布視野的綠色熒光,而未轉染的RK3E細胞只見黑色背景。該試驗表明,采用shRNA質粒表達載體轉染哺乳動物細胞,就可以持續的轉錄出shRNA,通過篩選形成穩定表達shRNA的細胞系,便于進一步研究基因沉默的作用效果。與siRNA介導的 RNAi作用相比,shRNA介導的RNAi作用能更長期,甚至穩定地抑制目的基因的表達,更適合于對目的基因功能進行長期研究。

在腎臟C5aR主要表達在腎臟系膜細胞和近曲小管上皮細胞,遠曲小管和輸尿管、膀胱的移行上皮細胞也均有C5aR的表達。C5aR可能參與了腎臟上皮細胞多種細胞因子和補體成分的產生,誘導單核細胞釋放TNF-α、IL-1、IL-6和IL-8等細胞因子。在血液循環中較低的C5a濃度就可以誘導粒細胞應答,而如果組織表達C5aR,則通過與C5a的結合,使組織局部的C5a濃度比血液循環要高很多,更有利于粒細胞向炎癥部位聚集,而且還可以促進內皮細胞表達P選擇素,后者促進粒細胞粘附到血管壁,加速炎癥反應[8,9]。給實驗動物注射脂多糖可以引起腎臟、肺和肝的C5aR mRNA的表達增多,同時C5aR的表達也上調,說明其可能在組織炎癥反應中扮演重要角色。本實驗中觀察到,經LPS刺激12小時后,在未轉染的RK3E細胞、轉染空載體pRNAT-U6.1的RK3E細胞和轉染C5aR shRNA的RK3E細胞均出現C5aR mRNA及蛋白的表達,進而誘導腎臟上皮細胞出現凋亡。而與未轉染的RK3E細胞和轉染空載體的RK3E細胞相比,C5aR shRNA轉染RK3E細胞細胞凋亡率明顯下降,C5aR mRNA水平和蛋白活性顯著降低,該研究表明,一方面,LPS可以誘導腎臟上皮細胞RK3E出現凋亡,該細胞凋亡的發生與C5aR的表達增高有關,在試驗中C5aR mRNA水平和蛋白均顯著升高。另一方面,C5aR shRNA對LPS誘導的RK3E細胞凋亡起到抑制作用,其主要機制是沉默RK3E細胞中的C5aR基因,試驗中C5aR mRNA水平較未轉染的RK3E細胞和轉染空載體的RK3E細胞顯著降低,說明了C5aR的基因沉默作用,C5aR基因沉默從而發揮抑制凋亡的作用。另外,我們在LPS的刺激性,測定了125I-rrC5a與未轉染的RK3E細胞、轉染空載體pRNAT-U6.1的RK3E細胞和轉染C5aR shRNA的RK3E細胞的結合活性,發現經C5aR shRNA處理的RK3E細胞其結合活性顯著減低,提示經RNA干擾處理的RK3E細胞表達C5aR顯著降低,進一步證實了采用RNA干擾技術可以有效的沉默腎臟上皮細胞表達C5aR。因此,我們設想,采用針對C5aR的shRNA來干預細胞凋亡過程,可以作為抑制腎臟缺血再灌注損傷等病理生理過程的一條有效途徑,并有可能為研制含有siRNA的藥物來抑制細胞凋亡的發生提供了思路[8,9]。

本文研究表明,通過攜帶C5aR的shRNA質粒表達載體pRNAT-U6.1轉染哺乳動物細胞是可行的,經過篩選可以形成穩定的表達C5aR shRNA的細胞系,形成持續shRNA表達,C5aR shRNA可以顯著抑制靶基因達到基因沉默的效應。LPS的刺激下, C5aR基因沉默可以明顯抑制腎臟上皮細胞的凋亡,該試驗為進一步研究抑制補體系統對腎臟缺血再灌注損傷的保護性作用等奠定條件。

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2 張 艷,陳 棟,貢福盛 et al.RNAi介導Caspase-3基因及其抑制LPS誘導腎臟上皮細胞凋亡的研究[J].中國免疫學雜志,2008;24 (1):16-19.

3 Fire A,Xu S,Montgomery M Ket al.Pomnt and specific genetic interference by doublestranded RNA in Caenorhabditis elegans[J].Nature,1998; 391(6669):806-811.

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[收稿2009-10-11]

(編輯 張曉舟)

Small hairpin RNA targeting rat C5aRcan inhibit the cell apoptosis induced by LPS in kidney epithelial cells

CHEN Dong,ZHANG Yan,LI Ming,YIN Zhu-Zeng,CHEN Gang,ZHANG Wei-Jie,CHEN Shi.Institute of Organ
Transplantation,Tongji Hospital,Tongji Medical College,Huazhong University of Science and Technology,Wuhan 430030,China

Objective:T o investigate RNA interference and apoptosis induced byLPS in kidney epithelial cells through silencing C5aR gene with small hairpin RNA(shRNA).Methods:We construct the eukaryotic expression vector of small hairpin RNA targeting rat C5aR gene, and transfected RK3E cell by electroporation,after G418 selection,so we got the stable cell line expressing C5aR shRNA.The experiment was designed into 3 groups:①normal control group,RK3E cells without transfection;②negative control group,RK3E cells transfected with blank vector;③experimental group,RK3E cells transfected with C5aR shRNA.After incubation withLPSfor 12 h,the ratio of apoptosiswas tested by flow cytometry,the level of mRNA was tested by RT-PCR,and bindingof125I-rrC5a to RK3E cells stimulated withLPSwere performed to examine the expression of C5aR in RK3E cells.Results:Compared with the normal control group and negative control group,in the experimental group the ratio of apoptosis was significantly decreased(P<0.01),and the expression of C5aR mRNA was significantly inhibited(P<0.01), and binding of125I-rrC5a to RK3E cells was significantly decreased also.Conclusion:Hairpin shRNA targeting C5aR gene can lead to obvious gene silence in vitro and inhibit the cell apoptosis induced by LPS in kidney epithelial cell.

RNA interference;C5aR;Gene silence;Apoptosis

R392.1 文獻標識碼 A 文章編號 1000-484X(2010)02-0151-04

①本文為教育部留學回國人員科研啟動基金項目和國家自然科學基金(30600573)資助項目

②華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院綜合醫療科,武漢430030

③通訊作者,E-mail:yzhang1977@yahoo.com.cn

陳 棟(1973年-),男,醫學博士,主要從事器官移植臨床及移植免疫方面的研究,E-mail:dchen0369@yahoo.com.cn。