弓形蟲主要抗原及其疫苗的研究進展

張清國(綜述),黃炳成(審校)

2.濟寧醫(yī)學院,濟寧 272013

弓形蟲主要抗原及其疫苗的研究進展

張清國1,2(綜述),黃炳成1(審校)

2.濟寧醫(yī)學院,濟寧 272013

弓形蟲病(Toxoplasmosis)是由專性細胞內寄生的弓形蟲病原體引起的一種人獸共患寄生蟲病,廣泛流行于我國和世界各地〔1〕。特別是近年來隨著人們生活水平的提高,食物來源的多樣化,飲食習慣的改變,飼養(yǎng)寵物人數的增多,弓形蟲感染呈明顯上升趨勢,已引起國內外學者的高度關注,并對弓形蟲主要抗原及其免疫特性進行了大量的探索研究,認為研制安全、有效的疫苗成為預防與治療弓形蟲病的發(fā)展方向。弓形蟲抗原的研究工作經歷了全蟲抗原、蟲體特異組分抗原和重組抗原階段,其疫苗研究也經歷了滅活疫苗、減毒活疫苗、亞單位疫苗、基因工程疫苗和核酸疫苗的發(fā)展階段〔2-3〕。本文將對近年來弓形蟲主要抗原及其疫苗的研究進展作一綜述。

1 弓形蟲膜表面抗原

1.1 主要表面抗原1(SAG1) SAG1是速殖子表面抗原,又稱 P30。1988 年 Burg JL〔4〕等首先克隆并分析了P30基因的序列,基因全長1 634bp,是單一拷貝基因,不含有內含子。其編碼區(qū)序列(CDS)從311～1 321bp,其中311～541bp編碼疏水性的信號肽序列。Mineo JR〔5〕對 P30抗原在弓形蟲入侵宿主細胞過程中的作用進行研究,發(fā)現鼠抗P30多克隆抗體能抑制速殖子對成纖維細胞的粘附接近75%,單克隆抗體可抑制65%;而P30突變株結合細胞的能力明顯下降,說明P30在粘附宿主細胞膜的過程中起到配體的作用。鑒于此,研究者對P30作為候選疫苗的免疫保護性和診斷抗原的特異性進行了大量的研究,P30基因已分別在原核、真核和昆蟲細胞中表達,表達蛋白有融合和非融合兩種形式。研究表明P30是一個高度構象決定性抗原,表達產物的抗原活性與蛋白分子的正確折疊密切相關〔6-7〕。Qu D〔8〕等利用減毒的鼠傷寒沙門氏菌表達SAG1,構建了減毒活疫苗ZJ111/pSAG1-MIC3,口服免疫小鼠后可產生特異體液免疫和 Th1型細胞免疫(P＜0.05);RH強毒株弓形蟲攻擊實驗結果顯示,107和108CFU免疫組小鼠的成活率分別為20%和10%,而對照組小鼠全部死亡;免疫前和免疫后4w小鼠體重沒有明顯變化,并且免疫后6w脾臟和肝臟中的重組沙門氏菌被清除。Shang L〔9〕等用兩種DNA疫苗 pVAX/TgSAG1和重組偽狂犬病毒rPRV/TgSAG1加強免疫效果,免疫組小鼠存活時間明顯延長(15.4+/-5.0 d),存活率達40%,而對照組小鼠在 11d內全部死亡。Zhou XH〔10〕等將含有SAG1復合基因片段置于植物表達載體的E35S、E82.2啟動子和E35S-E81.1嵌合啟動子下,通過土壤桿菌轉化土豆,Western blot檢測顯示,8株土豆能夠成功表達預期的11 900分子量大小的蛋白質,其中2株能被SAG1單克隆抗體識別,為弓形蟲的疫苗研制提供了新的方法和途徑。

1.2 主要表面抗原2(SAG2) SAG2也是速殖子表面的一個抗原,又稱P22。SAG2基因也是單拷貝基因,不含內含子,分子量22kDa。SAG2在弓形蟲入侵宿主細胞及在其中的繁殖中起著重要的作用。用抗SAG2單克隆抗體中和SAG2后可將速殖子固定在宿主細胞膜表面阻止其入侵。因此,SAG2可能在速殖子入侵宿主細胞中起著重要的作用,可作為亞單位或重組疫苗的候選分子。王芳等〔11〕將SAG2基因亞克隆至酵母菌分泌表達載體pPICZα A中,再電轉化轉染至畢赤酵母菌GS115菌株,僅在重組酵母細胞內表達了分子質量為22 kDa的蛋白。以該重組酵母菌作為疫苗腹腔免疫BALB/c小鼠后產生了特異性抗SAG2抗體,表明具有一定的免疫原性。李俊華等〔12〕構建了含有穿梭表達質粒ps3000-SAG2或ps3000-GRA4的重組BCG疫苗,接種小鼠后發(fā)現弓形蟲SAG2和GRA4重組BCG疫苗均能誘導小鼠產生免疫應答,分別于免疫后第 4、6、8wCD4+/CD8+、IgM 、IgG 抗體水平均有不同程度的提高。RH強毒株弓形蟲速殖子攻擊后,BCG-SAG2組平均存活8.61d,PBS對照組平均存活7.33d,3個免疫組小鼠比其他3組的平均存活時間長1d,表明弓形蟲重組BCG疫苗具有一定的免疫保護性。

1.3 主要表面抗原3(SAG3) SAG3又稱P43,是存在于弓形蟲所有入侵階段的一個膜蛋白。未成熟的SAG3由385個氨基酸殘基組成,含有一個N端信號肽和GPI。SAG3是參與弓形蟲入侵宿主細胞的一個主要分子,介導弓形蟲對宿主細胞的識別和黏附。Lee YH 等〔13〕用重組GST-SAG3融合蛋白和GST-SAG3-QuilA(皂素的純化物)免疫BALB/c小鼠,發(fā)現免疫組小鼠IgG2a抗體滴度、CD8+T淋巴細胞百分比,IFN-γmRNA表達水平和NO生成量均較對照組明顯增加(P＜0.05);弓形蟲攻擊實驗結果顯示,免疫組小鼠的存活時間明顯延長,腦包囊數量明顯減少。說明重組SAG2能誘導T h1型免疫反應,對免疫小鼠具有部分保護性,Quil A具有免疫增強作用。

2 棒狀體蛋白

2.1 棒狀體蛋白1(ROP1) ROP1基因是一個單拷貝基因,全長約為2.1kb。ROP1蛋白約 60.5 kDa,其N端富含脯氨酸的酸性結構域,隨后是堿性羧基末端區(qū)域〔14〕。弓形蟲感染宿主細胞后,ROP1就出現在納蟲泡膜上,用抗ROP1的單抗處理后能抑制弓形蟲對宿主細胞的黏附。楊秋林〔15〕等將含有ROP1的重組質粒L2pS-ROP1-T導入乳酸乳球菌,用重組乳酸乳球菌口服免疫小鼠發(fā)現,免疫組小鼠血清IgG水平和小腸液SIgA水平較對照組均有顯著增高,提示該重組乳球菌能在小鼠小腸表達ROP1,且能誘導系統和黏膜局部的體液免疫應答,但攻擊感染實驗結果顯示,免疫組小鼠無明顯免疫保護性。

2.2 棒狀體蛋白2(ROP2) ROP2是弓形蟲棒狀體分泌的另一個重要的蛋白,又稱P54。ROP2基因全長2 234bp,不含內含子,未成熟的ROP2前體蛋白約66kDa,成熟的 ROP2約為54kDa,它也參與弓形蟲侵入后納蟲泡膜的形成。在弓形蟲入侵宿主細胞時由棒狀體分泌到宿主胞質中,其羧基端定位于納蟲泡膜上,氨基端以可溶形式游離于宿主胞質中,與宿主的線粒體和內質網的聯合有關。它在弓形蟲生活史的速殖子期、緩殖子期以及子孢子期均有表達。最近研究發(fā)現ROP2家族的氨基端存在一系列的兩親性螺旋,單一的螺旋就可以粘附于細胞膜上,共同作用則優(yōu)先粘附于新形成的納蟲泡膜〔16〕。Dziadek B〔17〕等用大腸桿菌E.coli表達的重組ROP2和ROP4免疫C3H/HeJ小鼠,發(fā)現兩種重組抗原均能誘導產生系統性 Th1和Th2型免疫反應,以IgG1抗體為主。二者對弱毒DX株弓形蟲的攻擊實驗均能提供部分保護性,免疫組腦組織中包囊數量減少46%。說明原核表達的重組 ROP2抗原能提供部分的免疫保護性,弓形蟲不同時期的保護性抗原進行聯合免疫的混合成分、多效價重組蛋白疫苗具有一定的應用前景。Wang H〔18〕等將ROP2基因全長序列克隆至分支桿菌表達載體pMV162的熱休克蛋白hsp60啟動子下,構建重組穿梭質粒pMV262-ROP2,電穿孔轉化至BCG,獲得重組BCG/pMV262-ROP2活疫苗,Western blot鑒定重組BCG能夠表達ROP2蛋白。免疫BALB/c后發(fā)現重組BCG能誘導小鼠產生特異性的抗ROP2免疫反應,免疫組小鼠的死亡時間比對照組明顯延長(P＜0.05)。表明重組BCG能有效表達和遞呈弓形蟲ROP2抗原,能誘導產生針對弓形蟲感染的免疫反應 。魏慶寬〔19〕、張佃波〔20〕等已成功構建 pc-DNA3-ROP2、pET-ROP2-P30等重組質粒,分別用其重組體或表達蛋白免疫小鼠,均能能誘發(fā)小鼠產生細胞免疫和體液免疫反應。免疫組小鼠血清抗體滴度高、CD4+T細胞增殖明顯、CD4+/CD8+顯著升高(P＜0.01);其脾淋巴細胞培養(yǎng)液及血清中多種細胞因子均有不同程度的升高。RH株弓形蟲攻擊感染后,實驗組小鼠免疫保護率為88.9%,與對照組相比,小鼠存活時間明顯延長、初始死亡時間明顯延遲(P＜0.01)。可見ROP2蛋白、P30(SAG1)蛋白均為很有前途的疫苗候選抗原。

3 微線體蛋白

3.1 微線體蛋白2(MIC2) 研究發(fā)現弓形蟲微線體蛋白2(TgMIC2)基因為單拷貝基因,含3個內含子,ORF全長2 307bp,編碼含769個氨基酸殘基,該蛋白Mr為115 000,在698～718位氨基酸殘基之間有一個短的疏水信號肽,為典型的跨膜區(qū)。TgMIC2在蟲體的各期都有表達,TgMIC2和TgM2AP以1∶1的比例形成復合體,該復合體為六聚體 ,包含 3 個 α β 二聚體。MH Huynh〔21〕等通過條件性基因表達調控系統將對無水四環(huán)素敏感的MIC2基因導入蟲體,從而敲除內源的MIC2基因,MIC2基因表達的減少導致M2AP不能正確運輸,蟲體對宿主細胞的粘附和入侵能力明顯減弱,螺旋狀滑移運動消失,對小鼠不能造致死性感染,并且感染小鼠組織中的原蟲負荷降低,炎性免疫反應減弱,獲得較長時間的保護性免疫。該研究表明MIC2蛋白是弓形蟲感染的主要毒力因素,而MIC2缺陷株是一種有效的活減毒疫苗。

3.2 微線體蛋白3(MIC3) 微線體蛋白3基因無內含子,ORF編碼一個富含半胱氨酸的395個氨基酸殘基的多肽,N端有一較短的疏水信號肽,無跨膜區(qū)域氨基酸序列中含5個表皮生長因子樣結構域(EGF-like domain),其中3個串聯排列,另2個與前3個有重疊,具有一個幾丁質連接樣結構域(chitin binding-like domain),這種序列能結合到宿主細胞上,跟宿主蛋白一樣參與細胞與細胞、細胞與細胞外基質的相互識別作用。由于MIC3在弓形蟲的速殖子、緩殖子和子孢子期都能表達,因此被認為是在弓形蟲病的診斷和疫苗研制上非常有前景的候選分子。江濤等〔22〕發(fā)現MIC3基因在大腸桿菌中表達的融合蛋白經初步分離提純后,1L培養(yǎng)液約含融合蛋白143mg,目的蛋白表達量占菌體總蛋白的49%。Ismael AB〔23〕等發(fā)現編碼表皮生長因子樣結構域或幾丁質連接樣結構域的DNA疫苗均能提供一定的保護性。Fang R〔24〕等將 MIC3基因克隆至“自殺式”載體(suicidal vector)pSCA1,并比較了pSCA/MIC3和傳統真核表達載體疫苗pcDNA/MIC3的免疫保護性,二者分別免疫BALB/c小鼠后發(fā)現兩組小鼠的抗MIC3蛋白特異性抗體滴度、淋巴細胞體外增值反應的刺激指數和IFN-γ的表達水平均較對照組明顯增高(P＜0.05),隨后的攻擊實驗結果表明,兩組小鼠的存活時間均較對照組顯著延長,兩免疫組間無差異。說明“自殺式”載體疫苗與傳統核酸疫苗相比,也能提供較好的免疫保護性。由于其不能在宿主體內復制,較傳統核酸疫苗具有更大的生物安全性,是一種很有潛力的疫苗。利用敲除MIC1和MIC3基因的RH株速殖子免疫OF1小鼠后,能夠誘導強烈的體液免疫和Th1型細胞免疫反應,腦部組織包囊比對照組減少96%。并能阻斷垂直傳播,新生胎兒的感染率為4.6%而對照組高達 33.3%〔25〕。

4 致密顆粒蛋白

4.1 致密顆粒蛋白1(GRA1) 弓形蟲侵入宿主細胞后納蟲泡形成,此后不久,弓形蟲的另一類細胞器—致密顆粒開始釋放內容物,即致密顆粒蛋白(如GRA1、GRA2、GRA4和GRA6 等),其中部分蛋白分布到納蟲泡膜的表面。GRA1又稱為P24,其天然蛋白質分子量為23kDa,含有2個鈣結合域,通過調節(jié)鈣離子濃度來穩(wěn)定納蟲泡膜。M Doskaya〔26〕等利用網絡生物信息學技術對重組GRA1蛋白的結構進行預測,發(fā)現重組GRA1蛋白為折疊構象,適合對其結構、生物化學和疫苗的研究。謝榮華等〔27〕利用畢赤酵母菌 GS115真核表達 GRA1蛋白,用其經皮膚免疫小鼠發(fā)現,免疫組小鼠抗體水平高于混合蛋白組、福氏佐劑對照組和生理鹽水對照組,且隨免疫次數的增加抗體水平逐漸增高;CD8+細胞數則顯著增殖,CD4+細胞數無明顯增殖,CD4+/CD8+比值明顯減少。免疫鼠受RH株速殖子攻擊后存活時間明顯延長,表明酵母菌表達的GRA1蛋白免疫小鼠具有一定的免疫保護作用。由于酵母表達系統易培養(yǎng)且表達量高,可進行疫苗大批量生產。

4.2 致密顆粒蛋白2(GRA2) GRA2又稱P28,基因全長約1.3kb,含有一個長241bp的內含子,其初級翻譯產物為一個由185個氨基酸組成的多肽,含有23個氨基酸長的信號肽,該產物富含絲氨酸和蘇氨酸,推測GRA2可能是一個糖蛋白。GRA2依賴3個兩性α螺旋(α 1:70～92,α 2:95～ 110和 α 3:119～139),在弓形蟲侵入后起著誘導納蟲泡表面網絡結構形成的作用。GRA2突變株雖然可以在成纖維細胞和巨噬細胞中正常的生長,但是弓形蟲的毒力卻大大下降,用GRA2突變株感染小鼠后,其存活率提高了許多,部分小鼠在急性感染后可以存活下來,說明GRA2可能是弓形蟲毒力相關的一個基因。利用重組GRA2蛋白和佐劑單磷酰脂質A(MPL)免疫CBA/J小鼠后,能誘導產生高比例的IgG2a/IgG1特異性抗體,脾細胞體外經分泌-排泄抗原刺激后產生大量的IFN-γ和IL-2。經腹腔接種弓形蟲包囊后,免疫組小鼠腦中包囊數明顯少于對照組。說明重組GRA2能有效抵抗弓形蟲慢性感染〔28〕。

4.3 致密顆粒蛋白3(GRA3) GRA3為單拷貝基因,GRA3的cDNA序列N端有2個起始密碼子,其開放閱讀框含有一個22氨基酸的疏水區(qū)和一個信號肽。GRA3蛋白分子量為30kDa,集中于內管網和納蟲泡膜(PVM),其功能可能為蟲體獲取營養(yǎng) 。為進一步明確 GRA3 的功能,MP Craver〔29〕等用氯霉素抗性基因取代II型弓形蟲株的GRA3基因,獲得GRA3基因缺失株△GRA3。研究發(fā)現野生株WT和缺失株△GRA3的在生長速度和緩殖子轉化方面沒有差異。而其感染小鼠的劑量為WT株半數致死量的4倍,而且所有△GRA3感染小鼠度過急性感染期。說明GRA3在弓形蟲的急性感染期具有重要的作用。

4.4 致密顆粒蛋白4(GRA4) GRA4為單拷貝基因,無內含子,主要在速殖子中表達,翻譯產物是一種分子質量單位為40ku的致密顆粒蛋白。GRA4基因全長1 536bp,內含一個1 038bp的開放閱讀框架,能編碼 346個氨基酸。GRA4富含脯氨基(12%),內含一個由19個氨基酸殘基組成的疏水區(qū)域。李俊華等〔30〕將GRA4基因克隆入pGEM2T載體,然后亞克隆構建ps3000-GRA4大腸埃希菌-分枝桿菌穿梭質粒,再電轉化至恥垢分枝桿菌。用重組恥垢分枝桿菌免疫小鼠,Western blot分析顯示免疫小鼠血清能夠識別GRA4重組蛋白,表明重組恥垢分枝桿菌能在小鼠體內表達GRA4蛋白且具有抗原性,能刺激小鼠機體產生特異性抗弓形蟲抗體。由于恥垢分枝桿菌是一種生長快,轉化率高的突變株,并且本身也是一種非致病性和強的免疫佐劑,因此可以作為一種疫苗載體,該研究為弓形蟲疫苗研究提供了新的途徑。CHEN Rui等〔31〕利用脂質體包裹核酸疫苗pcDNA3.1-GRA4,通過肌肉注射免疫C57BL/6小鼠。末次免疫后14d,經口感染80個ME49株包囊,結果脂質體組小鼠的生存率達到72.7%,單獨接種pGRA4組的生存率為54.5%,而空質粒對照組小鼠全部死亡。表明GRA4為良好的抗弓形蟲感染疫苗候選抗原,而有效的基因遞送系統可以誘導更有效的免疫反應。

4.5 致密顆粒蛋白7(GRA7) GRA7基因長約1.3kb,不含內含子,含有一個N端信號肽和一個潛在的糖基化位點,C端具有2個疏水區(qū),其中靠近C末端的疏水區(qū)含有跨膜結構域。Joe Dan Dunn〔32〕等發(fā)現在蟲體入侵宿主細胞的10min內,GRA7以串樣結構出現在宿主細胞胞漿內,該串樣結構還包括GRA1和GRA3,GRA7的磷酸化僅出現在宿主細胞內,與ROP2和ROP4結合。

5 展 望

弓形蟲疫苗從最早采用的死蟲疫苗到核酸疫苗,取得了令人鼓舞的成就,但是離實際應用于人體還有一段距離。雖然弓形蟲是單細胞生物,但其生活史復雜,形態(tài)多樣,宿主廣泛,各抗原的免疫特性和致病分子機制亦不相同,復合型疫苗具有解決這些問題的潛力。核酸疫苗在其實用性、安全性及有效性方面顯示出較好的優(yōu)勢,能同時誘導機體產生高水平的保護性體液免疫和細胞免疫。因此,弓形蟲復合型疫苗和核酸疫苗仍是今后的研究方向。

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R382.5

A

1002-2694(2010)07-0683-05

黃炳成,Email:hbc863@hotmail.com

1.山東省寄生蟲病防治研究所,濟寧 272033;

2010-01-08;

2010-03-30