芍藥苷下調PC12細胞酸敏感離子通道1a的表達拮抗酸誘導的鈣內流

曹碧茵，孫 雪，楊亞萍，，孔 巖，劉春風，

(1.蘇州大學附屬第二醫(yī)院神經內科，江蘇蘇州 215004;2.蘇州大學神經科學研究所，江蘇蘇州 215123)

CAO Bi-yin1，SUN Xue1，YANG Ya-ping1，2，KONG Yan2，LIU Chun-feng1，2

(1.Dept of Neurology，the Second Affiliated Hospital of Soochow University，Suzhou Jiangsu 215004，China;2.Institute of Neuroscience，Soochow University，Suzhou Jiangsu 215123，China)

酸敏感離子通道(acid sensing ion channels，ASICs)是一類能被細胞外H+激活的陽離子通道，其中的ASIC1a亞基能介導鈣的內流，參與了腦缺血缺氧、帕金森病(Parkinson’s disease，PD)、亨廷頓舞蹈病(Huntington’s disease，HD)等神經系統(tǒng)疾病的病理過程［1］。阻斷ASIC1a的激活或降低其表達均可起到一定的神經保護作用［2］，為神經退行性疾病提供了一個新的防治策略。本研究在PC12細胞上觀察酸性培養(yǎng)液對細胞內游離鈣離子濃度、ASIC1a轉錄及表達的影響，并給予芍藥苷(Paeoniflorin，PF)進行干預，ASICs的非特異性阻斷劑阿米洛利(amiloride，Ami)作為陽性對照藥物，以探討PF對ASIC1a的表達是否具有抑制作用。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑 芍藥苷標準品購自中國藥品生物制品檢定所;Amiloride、Fluo-3/Am購自Sigma公司;RPMI 1640培養(yǎng)基、新生牛血清購自Gibco公司;定量RT-PCR試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司;兔抗ASIC1抗體購自Alpha Diagnostic International公司;小鼠抗β-actin抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔及山羊抗小鼠抗體、ECL發(fā)光劑等均購自碧云天生物技術研究所。

1.2 細胞培養(yǎng)及處理 PC12細胞用RPMI 1640完全培養(yǎng)基(含10%新生牛血清)進行常規(guī)培養(yǎng)。實驗前1 d接種于6孔培養(yǎng)板，穩(wěn)定生長24 h，將細胞分為4組:正常對照組(control)更換為pH 7.2的新鮮培養(yǎng)基;酸處理組(pH 6.0)更換為pH 6.0的酸性培養(yǎng)基;Ami組和PF組則分別在酸性培養(yǎng)基內加入 Ami(100 μmol·L－1)或 PF(50 μmol·L－1)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.3 流式細胞儀檢測細胞內鈣離子濃度的變化 收集細胞，預冷無鈣磷酸鹽緩沖液(PBS)洗2次，調整細胞濃度為1×109·L－1。取 200 μl細胞懸液，加入終濃度為 10 μmol·L－1的 Fluo-3/Am，37℃ 孵育 30 min，漂洗后重懸于 200 μl PBS中，上流式細胞儀檢測，激發(fā)波長488 nm，每組取10 000個細胞的熒光強度值的平均值為每份標本的測定值。

1.4 定量RT-PCR檢測ASIC1a mRNA轉錄水平 提取細胞總RNA，按試劑盒說明書進行RT反應，得cDNA模板。根據(jù)目的基因在GenBank中的已知序列，由寶生物工程(大連)有限公司設計合成引物。ASIC1a引物:上游5′-GCCCACATCTTCTCCTAT-3′，下游 5′-CTTGGTGACGTGGTGATA-3′;β-actin 引物:上游 5′-TCAGGTCATCACTATCGGCAAT-3′，下游 5′-AAAGAAAGGGTGTAAAACGCA-3′。兩步法進行 PCR反應，同時測定各樣本的溶解曲線。每樣本做3個復管，求出各樣本平均 Ct(cycle threshold)值，再按2－△△Ct進行相對定量分析，求出各組細胞ASIC1a mRNA相對于正常對照組的Fold值。將上述過程重復3次，進行統(tǒng)計學分析。

1.5 Western blot檢測ASIC1a的蛋白表達 收集細胞，提取細胞總蛋白。經濃度測定及變性后，取30 μg總蛋白進行SDS-PAGE電泳，將膠上蛋白轉移至PVDF膜，封閉后分別加入ASIC1(1∶1 000)和 β-actin(1∶1 000)抗體4℃孵育過夜。次日TBST洗3次，加入HRP標記的二抗(1∶1 000)37℃孵育2 h，ECL發(fā)光法顯影于X光膠片上。免疫印跡條帶密度=面積×灰度，每個樣本的條帶密度與同一樣本的β-actin進行比較求出比值，再計算出相對于正常對照組的Fold值。將整個實驗重復3次，進行統(tǒng)計學分析。

2 結果

2.1 各組細胞內游離鈣離子濃度的變化 pH 6.0組Fluo-3的平均熒光強度為4.55±0.45，高于 control組(2.44±0.03，P=0.015);與pH 6.0組相比，Ami組和PF組的熒光強度降低(3.15±0.38)s(P=0.003)、(3.01±0.18)s(P=0.002)，但是control組、Ami組和PF組之間的差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.2 各組細胞ASIC1a mRNA轉錄水平的變化 pH 6.0組ASIC1a mRNA的轉錄水平升高至control組的(3.36±1.30)倍，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.035)。與pH 6.0組相比，Ami組和 PF組 ASIC1a mRNA轉錄水平均明顯降低(0.63±0.48)s(P=0.007)、(1.19±0.31)s(P=0.018)，但是control組、Ami組和PF組之間的差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.3 各組細胞ASIC1a蛋白表達的改變 pH 6.0組ASIC1a的蛋白表達水平升高到control組的(1.29±0.11)倍，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.047)。與pH 6.0組相比，Ami組和PF組ASIC1a的表達降低(0.58±0.16)s(P=0.004)、(0.70±0.23)s(P=0.010)，但是 control組、Ami組和 PF組之間的差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

3 討論

ASIC1a亞基在中樞神經系統(tǒng)廣泛表達，可直接或間接促進鈣離子內流，引起隨之發(fā)生的鈣超載和細胞凋亡［2］。ASICs與PD、HD等神經系統(tǒng)疾病的關系日益得到關注，阻斷ASIC1a的通道功能或利用基因敲除技術減少ASIC1a的蛋白表達均能起到治療作用［3，4］。尋找以ASICs為靶點的藥物，設計和改造具有高選擇性和高活性的ASICs抑制劑成為神經生物學和藥物化學的研究熱點之一。

PF是芍藥的主要活性成分，抑制炎癥反應［5，6］、減少鈣內流、清除活性氧［7］、拮抗神經細胞的受損死亡，在 PD［8］、腦缺血缺氧［9］、癲癇等多種病理模型中發(fā)揮了神經保護作用，而這些病理模型均表現(xiàn)出局部的組織酸化現(xiàn)象，并發(fā)現(xiàn)了ASICs的異常激活。因此，ASICs可能是PF發(fā)揮神經保護作用的潛在靶點。

本研究利用pH 6.0的酸性培養(yǎng)基特異性地激活ASIC1a亞基，導致PC12細胞內游離鈣離子升高，ASIC1a的表達水平明顯上調。PF不但降低了細胞內游離鈣離子濃度，還使ASIC1a的轉錄和表達均維持在正常狀態(tài)，其藥效與Ami相比沒有明顯差異，并且有效濃度低于Ami，因此PF有可能是ASIC1a的天然抑制劑。

(致謝:蘇州大學放射醫(yī)學與公共衛(wèi)生學院、江蘇省放射醫(yī)學與防護重點實驗室為本研究提供了良好的科研條件和大力支持。)

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