殼聚糖微球作為鼻黏膜免疫載體的研究進展*

黏膜免疫是動物機體防御傳染病的第一道屏障,而鼻黏膜是許多病原微生物進入機體的必經之路。鼻黏膜免疫與局部或全身性免疫相比,有許多優點,例如鼻黏膜免疫無刺激、無痛感、為非侵入性,且不需要嚴格的無菌處理。鼻腔內大量的微絨毛構成鼻黏膜較大的表面積,多孔的內皮組織及高度血管化的上皮組織可以起到很好的遞呈作用。盡管鼻黏膜免疫有明顯的優勢,但是疫苗在鼻腔內的低滲透性和短暫的停留時間,嚴重阻礙了鼻黏膜的遞呈。而有效的鼻黏膜載體可以提高其抗原的免疫原性,并對處于該環境中的抗原起到保護作用〔1〕。

殼聚糖微球作為鼻黏膜藥物遞呈系統的載體,已經在許多疫苗中被廣泛深入的研究,如蛋白質、多肽及核酸疫苗。為了提高藥物的生物利用度及細胞膜的通透性,或提高實現持久釋放藥物的能力,殼聚糖微球首先被醇化,再與透明質酸及普郎尼克F127形成復合物來發揮作用〔2〕。

1 鼻黏膜免疫

1.1 鼻黏膜免疫的優點 黏膜表面是機體防御感染的第一道防線,大多數病原體都是通過胃腸道黏膜、呼吸道黏膜及生殖道黏膜引起宿主感染,可以把黏膜作為理想的疫苗接種位點。一些研究表明,對于相同的疫苗免疫途徑來說,鼻黏膜免疫比口服免疫更有效,尤其對于嚙齒類動物的免疫。

鼻黏膜表面上皮細胞上的微絨毛,提供了很大的膜表面積,能提高鼻黏膜的吸收效率。由鼻腔遞呈途徑免疫,藥物及疫苗可直接在黏膜表面被吸收,從而避免了經胃腸道免疫所造成的破壞。此外,鼻腔中酶活性相對較低,對疫苗免疫的需求量相對較少,并且可以保護疫苗不受酶的降解。Arora等〔4〕報道,與口服免疫相比,抗原經鼻黏膜免疫的劑量為口服免疫劑量的四分之一,但仍可在血清及黏液中誘導強有力的抗原特異性抗體反應。鼻黏膜富含脈管系統及高通透性的結構,使之能通過鼻黏膜上皮細胞吸收藥物。因此,可以通過控制藥物的逐漸釋放來達到治療的目的。

鼻黏膜疫苗免疫,不僅可以誘導產生全身性IgG抗體反應,還可以產生黏膜IgA抗體反應,最終形成兩道防御體系來共同保護機體免受傳染性疾病病原的侵害〔2〕。鼻腔中含有豐富的樹突狀細胞,可以介導強大的全身性及黏膜免疫反應,可以防御各種抗原及病原體通過呼吸系統對機體的侵害。

鼻黏膜免疫,由于抗原特異性淋巴細胞分布在機體共同黏膜免疫體系中,所以,可以在遠距離的黏膜位點誘導特異性的IgA抗體的免疫反應,包括上呼吸道、下呼吸道和腸道黏膜,以及鼻咽、唾液腺、生殖道及扁桃體〔2〕。有研究顯示,鼻黏膜免疫可在唾液腺及生殖道中產生抗原特異性免疫反應。結果發現,刺激后的淋巴細胞遷移到了共同黏膜免疫系統的特異性效應因子位點,這與黏膜特異性淋巴細胞歸巢理論一致。

1.2 鼻黏膜免疫的缺點 盡管疫苗通過鼻黏膜免疫有許多優點,但是由于具有一些局限性,從而阻礙了鼻黏膜疫苗的發展。鼻黏膜免疫最重要的局限性之一是存在于黏膜表面的黏膜纖毛對疫苗制劑的快速清除作用。物質在進入鼻腔的21 min內,會被鼻黏膜上的黏膜纖毛清除,已報道的人類鼻黏膜的清除時間是12～15min〔5〕。因此,降低黏膜纖毛的清除速率,可以延長抗原與鼻黏膜的接觸時間,從而增強藥物的透過性,提高疫苗的免疫效果。

鼻黏膜免疫另一個重要的局限性是鼻腔中所含酶類對侵入物質的降解作用,將阻礙藥物的通透性及黏膜的吸收。這是由于細胞色素酶、非氧化性脫氨酶、蛋白水解酶等一些代謝酶的作用而導致。已報道的鼻黏膜上的蛋白水解酶,可以降低對其藥物中縮氨酸的吸收。值得注意的是,鼻黏膜上的氨肽酶可對生物藥劑中的蛋白質及多肽進行降解〔6〕。有報道顯示,鼻腔中的P-450依賴性單氧酶系統可以代謝酒精、尼古丁、,可卡因等化合物。因此,一些治療藥物,包括鼻黏膜途徑遞呈的疫苗,往往都受限于鼻腔中的酶促降解作用〔6〕。

不含任何黏膜保護劑的疫苗在鼻黏膜免疫時,可能會誘發如貝爾氏麻痹綜合癥等一些嚴重的臨床癥狀。Mutsch等〔7〕報道,2000-2001年期間用于瑞士的滅活流感疫苗,由于未加黏膜保護劑,在鼻黏膜接種后,其接種者患貝爾氏麻痹綜合癥的風險顯著增高。同時,鼻黏膜免疫過程中,還要涉及鼻腔內環境對抗原的影響,這包括黏膜分泌物對其的稀釋作用,可溶性抗原未被攝取以及上皮細胞對其的排斥等,尤其是含量低的可溶性非粘附性抗原,只能誘導低水平的免疫應答。因此,新型鼻黏膜疫苗的開發,主要通過鼻黏膜表面抗原遞呈系統的改進來實現。

2 殼聚糖微球

2.1 殼聚糖微球的理化特性 殼聚糖由于其無毒、具有生物相容性、可降解性、獨特的黏膜黏附性和高滲透性,已成為最有應用前景的聚合物之一。殼聚糖強有力的黏膜粘附性使之成為黏膜免疫途徑中最重要的藥物遞呈載體。此外,帶正電荷的殼聚糖與帶負電荷的黏液層之間因相互作用而緊密連接,使密接結合的黏膜層暫時打開,便于親水性高分子物質的運輸。殼聚糖強有力的黏膜粘附性還可以在藥物的遞呈過程中,提高藥物遞呈的通透性。鼻腔及口服藥物遞呈途徑的研究表明,與殼聚糖結合的大量高分子聚合物可通過黏膜屏障被吸收。殼聚糖的促吸收作用是由于它可以在疫苗制劑及鼻黏膜組織之間產生瞬時的旁通路效應。Jeong等〔8〕報道,殼聚糖在改變旁通路運輸中具有重要作用。

一些研究顯示,殼聚糖可在黏膜免疫中起到佐劑的作用。加入殼聚糖后進行鼻黏膜免疫的百日咳桿菌血凝素及其重組體毒素可以誘導強大的抗原特異性全身及黏膜免疫應答,混合殼聚糖的白喉毒素鼻黏膜免疫,可誘導全身及局部的免疫反應。也有一些研究表明,加入殼聚糖后黏膜接種,不但可以誘導體液免疫應答,還可以誘導細胞介導的免疫應答。Xie等〔9〕研究發現,殼聚糖作為免疫佐劑,可同時產生輔助性T細胞1(Th1)型和2(Th2)型免疫反應。混合殼聚糖的白喉疫苗經鼻黏膜免疫,可以產生混合型Th1/Th2免疫反應,表明該疫苗可同時誘導體液及細胞免疫應答。殼聚糖也具有免疫刺激活性,它可以激活巨噬細胞,促進細胞因子的產生及增強細胞毒性T淋巴細胞的反應。

高分子黏膜粘著劑的應用,可降低黏膜纖毛對侵入物的清除作用。一些研究顯示,殼聚糖可以延長鼻黏膜遞呈過程中藥物在吸收部位的停留時間。

2.2 黏膜載體顆粒 顆粒載體技術為疫苗遞呈系統的發展提供了一些有價值的參考。到目前為止,引入疫苗遞呈系統的載體主要有納米微球、感光乳劑、脂質體、人工構建的病毒亞載體、免疫刺激復合物、病毒樣顆粒等。這些微粒是疫苗遞呈系統的重要組成部分,他們可以刺激宿主的免疫系統,引起免疫應答。

首先,大多數載體顆粒以最適粒度通過黏膜系統進入機體被抗原遞呈細胞識別,這樣疫苗制劑就很容易被運輸穿過細胞膜。由于較小的顆粒(＜10 μ m)比較大的顆粒(＞10 μ m)具有更好的免疫原性,因此,顆粒大小的參數設定對提高其免疫原性非常重要。其次,與一些液體佐劑相比,載體顆粒可以延長疫苗在黏膜表面的停留時間。有報道稱,載體顆粒可以在鼻黏膜免疫中發揮直接作用,它可以引起黏膜上皮細胞脫水,使緊密連接的細胞分離。Kunisawa等〔10〕報道,載體顆粒與疫苗混合的優點在于,可延長疫苗的停留時間,以提高疫苗在黏膜表面的生物利用度及促進黏膜對其的吸收。Ahire等〔3〕研究顯示,殼聚糖微球包裹破傷風毒素口服免疫,在腸粘膜的洗滌液中可檢測出抗原特異性IgA,并且在外周血中也含有大量的抗原特異性IgG。

2.3 殼聚糖微球在鼻黏膜免疫中的作用 殼聚糖可以被制成不同的形態,如微球、納米球、薄膜及條狀顆粒。許多研究報道,殼聚糖微球主要作為鼻黏膜疫苗免疫的載體。有報道顯示,殼聚糖微球與白喉毒素混合鼻黏膜免疫,可以提高抗原特異性IgG的產生。Alpar等〔11〕實驗證明,加入殼聚糖微球后的牛血清白蛋白(BSA)與不加殼聚糖相比,能誘導更多的抗原特異性 IgG 抗體反應。Kang等〔12〕發現,殼聚糖微球包裹的支氣管敗血波士桿菌抗原經鼻黏膜免疫,免疫小鼠的鼻洗液中抗原特異性IgA滴度能顯著升高。此外,鼻洗液及唾液中IgA滴度可隨時間的延長而升高。

為了研制出更加有效的黏膜免疫疫苗,一些科學家研究了疫苗遞呈系統與黏膜佐劑的協同效應。Baudner等〔13〕人在研究中發現,重組大腸桿菌不耐熱毒素與殼聚糖微球按比例混合后鼻黏膜免疫小鼠,可以在血清中產生更高水平的抗原特異性IgG抗體,同時在鼻洗液中產生高水平的抗原特異性IgA。研究者同時還研究另一種N-三甲基殼聚糖微球,它與相關抗原混合,也可以誘導鼻洗液,陰道洗液及血清中高滴度的抗原特異性抗體。

特異性M細胞及黏膜相關淋巴組織(MALT)對顆粒性抗原載體的識別,是黏膜接種誘導效應性免疫反應的關鍵。Lim等〔14〕報道,殼聚糖微球包裹的質粒DNA納米粒子在MALT上被M細胞識別,并被遞呈到下一級的淋巴組織中。Khatri等〔15〕通過激光掃描電鏡觀察,熒光標記的卵白蛋白口服免疫后,殼聚糖可以提高淋巴結上皮細胞對其的攝取,隨后,被攝取的殼聚糖微球包裹的卵白蛋白可以通過免疫組化著色做進一步的觀察。

Khatri等〔16〕研究發現,Th1介導免疫反應所產生的細胞因子可以清除病原體對宿主的感染,殼聚糖納米粒子包裹的質粒DNA鼻黏膜免疫小鼠后,可提高IL-2和 IFN-γ的水平。Kumar等〔16〕報道,殼聚糖-DNA納米粒子鼻黏膜接種,可誘導細胞毒性T細胞(CT L)的免疫反應,并產生IFN-γ及特異性的IgA和IgG抗體。T h1依賴性細胞因子及CTL免疫反應的研究,證實了殼聚糖微球參與的鼻黏膜免疫,可以介導強大的細胞免疫應答。

2.4 甘露糖基化殼聚糖微球的鼻黏膜免疫 甘露糖受體主要存在于巨噬細胞和樹突狀細胞上,它在先天性及適應性免疫中具有重要作用。抗原的甘露糖基化是一個很具吸引力的研究,它可以通過與抗原遞呈細胞(APC)上的甘露糖受體位點結合來提高抗原的免疫原性。由于膜結合C型凝集素受體如巨噬細胞甘露糖受體(MMR)、樹突狀細胞內粘附分子(DC-ICAM)及胰島蛋白可被細胞質內吞形成網絡蛋白包裹的囊泡,所以甘露糖基化的抗原可以被此類細胞表達的受體所識別、吞噬、并釋放到早期核內體的酸性內環境中。此外,巨噬細胞甘露糖受體可識別含甘露糖殘基的抗原,并導入早期的核內體中,樹突狀細胞內粘附分子會直接將抗原導入成熟的溶酶體中進行降解,之后,巨噬細胞甘露糖受體再返回到細胞表面,把之后的外源性抗原遞呈給II類主要組織相容性復合體(MHC-II)分子。

甘露糖基化的抗原可以顯著提高對T細胞的刺激能力。Mitchell等〔17〕實驗證實,被甘露糖受體識別的抗原,對T細胞的刺激能力可增強100倍。此外,甘露糖基化的藥物遞呈系統如甘露糖基化脂質體及類脂質體,可以通過與抗原遞呈細胞上的甘露糖受體結合,來增強其抗原的免疫原性。

甘露糖基化的殼聚糖或殼聚糖微球在一些研究中被用來評價所介導的基因遞呈系統。Hashimoto等〔18〕研究顯示,甘露糖基化的殼聚糖是有效的基因遞呈系統,它具有高的轉染率及低的巨噬細胞毒性。甘露糖基化的殼聚糖被證明能有效的將IL-2基因遞呈給樹突狀細胞,從而增強抗腫瘤性免疫反應。Kim等〔19〕實驗表明,甘露糖基化的殼聚糖微球與DNA混合,可以有效的增強血清抗體水平及CTL反應。

在一些研究中,甘露糖基化的殼聚糖微球作為鼻黏膜疫苗免疫的載體來誘導受體介導的胞吞作用。甘露糖基化的殼聚糖微球(MCMs)是通過與三聚磷酸鹽的凝膠化方法來制備的。Porporatto等〔20〕研究顯示,殼聚糖可增強巨噬細胞的功能,并誘導細胞因子的產生及I類和II類主要組織相容性復合體的活化。因此,甘露糖基化的殼聚糖微球的應用可增強機體的免疫應答。

3 結 語

綜上所述,殼聚糖微球可以作為有效的鼻黏膜免疫載體。不同方法制備的殼聚糖微球作為遞呈工具用于鼻黏膜免疫,可以用于評價藥物的控釋能力、疫苗的保護性及抗原在黏膜表面的通透性。殼聚糖微球在鼻黏膜免疫中可增強其抗原的免疫原性,通過對殼聚糖微球的化學修飾,達到與抗原在免疫應答中的協同效應,或通過殼聚糖的甘露糖基化,來誘導受體介導的抗原遞呈細胞的遞呈作用。被殼聚糖微球包裹的抗原,經鼻黏膜免疫接種動物模型后,可誘導抗原特異性的鼻黏膜免疫應答及全身性的免疫應答。因此,殼聚糖微球作為鼻黏膜免疫的載體,具有其自身的研究價值和廣闊的應用前景。

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