弓形蟲病的分子診斷技術(shù)研究進(jìn)展*

弓形蟲病(Toxoplasmosis)是由剛地弓形蟲(Toxoplasma gondii)引起的呈世界性分布的嚴(yán)重危害人類健康和畜牧業(yè)發(fā)展的人獸共患寄生蟲病。免疫功能正常的人多呈隱性感染,而孕婦感染弓形蟲后可導(dǎo)致流產(chǎn)、早產(chǎn)、畸胎、死胎等,成為影響人類優(yōu)生優(yōu)育的一種重要生物病原。懷孕動物感染弓形蟲后出現(xiàn)流產(chǎn)、死胎,甚至還會引起患病動物大批死亡,給養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失。近年來,弓形蟲病的診斷方法以普通病原學(xué)和免疫學(xué)診斷為主,而隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展,逐步建立了核酸探針,PCR,基因芯片以及LAMP等多種快速、準(zhǔn)確的檢測方法,使該病的診斷方法日益完善。本文對弓形蟲分子診斷技術(shù)的發(fā)展加以綜述。

1 核酸探針技術(shù)

核酸探針技術(shù)又稱核酸雜交(nucleic acid hybridization),是由華盛頓卡內(nèi)基學(xué)院Roy Britten及同事于1968年發(fā)明的一種重要的分子生物學(xué)技術(shù)。該技術(shù)的基本原理是將某一特定病原已知基因的全部或者部分序列預(yù)先分離純化后加以標(biāo)記作為探針,與變性分開的待檢DNA或RNA單鏈在同一退火溫度下,相應(yīng)的同源區(qū)段便會發(fā)生特異性互補(bǔ),形成雜交雙鏈。洗滌除去未雜交上的標(biāo)記物后用自顯影技術(shù)進(jìn)行檢測,便可檢測出與特定序列結(jié)合的核酸樣品,從而達(dá)到檢測病原的目的。根據(jù)探針類型不同分為基因組DNA探針、RNA探針等。Blanco等〔1〕建立弓形蟲RH株基因文庫,從中篩選出pT g4重復(fù)片段。將此片段用放射性同位素32P標(biāo)記作為探針,可檢測到80pg純化的弓形蟲基因組DNA。

由于放射性同位素標(biāo)記的核酸探針容易污染環(huán)境,且對人體有一定損害。所以在推廣應(yīng)用上受到較大的限制。因此,近年來非同位素標(biāo)記核酸探針有了較大發(fā)展。Angel等〔2〕用地高辛標(biāo)記探針 ABGTg4檢測6例疑似弓形蟲腦炎患者的腦脊液,發(fā)現(xiàn)有4例陽性,與臨床檢出符合率到達(dá)100%。程彥斌等〔3〕利用地高辛配基(Dig-11-dUTP)標(biāo)記弓形蟲B1基因的部分序列(207 bp),通過斑點雜交能夠檢測出25pg的純化弓形蟲核酸。且特異性良好,用該探針檢測急性感染的小鼠,在感染24 h后可從組織中,48 h后可從外周血中檢測出弓形蟲。

2 PCR及其衍生技術(shù)

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase chain reaction,PCR)是20世紀(jì)80年代發(fā)展起來的一種體外核酸擴(kuò)增系統(tǒng)。其快速、靈敏、操作簡便等優(yōu)點使之在短時間內(nèi)即被廣泛應(yīng)用。目前,有很多基因可用作弓形蟲的PCR檢測,最常見的有B1基因,529 bp重復(fù)序列以及P30基因。它們在弓形蟲基因組中均具有高度保守的特點。PCR及其衍生技術(shù)已廣泛應(yīng)用于弓形蟲病臨床診斷,在分子生物學(xué)診斷中占有重要的地位。

2.1 普通PCR技術(shù) Burg等〔4〕利用弓形蟲 B1基因,首次將PCR技術(shù)用于弓形蟲病的診斷。其靈敏度可以達(dá)到檢測單個弓形蟲速殖子基因組DNA的水平。單連玉等〔5〕根據(jù)Burg建立的上述PCR方法,檢測感染組織內(nèi)的弓形蟲,肝臟組織樣本檢出率為81.8%,血液樣本檢出率達(dá) 100%。崔平等〔6〕以弓形蟲P30基因為PCR引物,可以檢測出5個弓形蟲速殖子的DNA。并且可在病豬的肝臟、肺臟、肺門淋巴結(jié)、脾臟、腸系膜淋巴結(jié)、腹水的DNA樣品中檢測出弓形蟲。該方法特異性較好。

2.2 PCR-RFLP技術(shù) 將PCR技術(shù)與限制性片段長度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)結(jié)合建立的PCR-RFLP技術(shù),可以在診斷弓形蟲病的基礎(chǔ)上鑒定弓形蟲的強(qiáng)、弱蟲株,揭示個體或群體間遺傳變異情況。Ferreira等〔7〕用間接免疫熒光、ELISA 以及PCR診斷確診87例患有弓形蟲病的艾滋病病人和腦弓形蟲病人后,對他們的腦脊液樣本采用4個基因標(biāo)記多位點PCR-RFLP進(jìn)行基因分型,并且這4個標(biāo)記能夠?qū)蜗x的3個無性繁殖的克隆世系進(jìn)行清楚的分型。結(jié)果發(fā)現(xiàn)除了經(jīng)典的Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型外,還發(fā)現(xiàn)了多態(tài)性蟲株,該實驗證實了弓形蟲巴西分離株具有很高的遺傳多態(tài)性現(xiàn)象。

2.3 原位PCR 將原位雜交技術(shù)的定位性與PCR技術(shù)的高敏感性結(jié)合起來的原位PCR(in situ PCR),能在組織切片或細(xì)胞涂片上原位對特定DNA或RNA進(jìn)行擴(kuò)增,省略了提取DNA的繁瑣步驟,對于樣本量少或不能獲得較大樣本組織的檢測提供了一個可行方法。按照檢測方式的不同可分為直接原位PCR和間接原位PCR。李爽等〔8〕利用直接原位PCR擴(kuò)增并檢測以弓形蟲RH株速殖子感染小鼠肝臟的切片標(biāo)本,病原體檢出率為100%,而用免疫組化方法檢測冷凍切片標(biāo)本的檢出率為61%,可見原位直接PCR方法較免疫組化法有很大的優(yōu)勢。盧慎〔9〕以弓形蟲 B1基因設(shè)計引物,并用地高辛標(biāo)記探針,采用間接原位PCR的方法檢測86例病理診斷為慢性非特異性淋巴結(jié)炎石蠟切片組織樣本,發(fā)現(xiàn)弓形蟲陽性率為54.65%。

2.4 套式PCR 套式PCR(Nested PCR)是一種利用2對引物(外引物和內(nèi)引物)對目的DNA序列進(jìn)行擴(kuò)增的診斷技術(shù)。靡祖煌等〔10〕以弓形蟲B1基因為靶基因,設(shè)計了4條特異性引物。以外套引物PCR體系進(jìn)行第1次擴(kuò)增,其產(chǎn)物作為第2次擴(kuò)增的模板。經(jīng)過2次擴(kuò)增,敏感性較普通PCR提高了100倍。除能在RH株與地方分離株DNA樣品中擴(kuò)增出條帶外,人組織及其它微生物DNA均擴(kuò)增不出任何條帶,提高了特異性。Esmerini等〔11〕用該方法以弓形蟲B1基因檢測海洋生物牡蠣和蛤蜊。在牡蠣樣本中,弓形蟲的出率為3.3%。而在蛤蜊樣本中,經(jīng)檢測證明沒有弓形蟲的存在。

在套式PCR的基礎(chǔ)上改進(jìn)設(shè)計的單管半套式PCR(hemi-nested PCR)檢測更為快速、敏感、特異。且由于在一個管內(nèi)完成2次擴(kuò)增反應(yīng),可減少污染機(jī)會,消除假象。現(xiàn)已成功應(yīng)用于弓形蟲病檢測。孔得翔等〔12〕針對弓形蟲RH株P(guān)30基因設(shè)計了3條特異性引物,建立了半套式PCR檢測體系。擴(kuò)增產(chǎn)物測序表明,與P30基因一致性為99.8%。且特異性強(qiáng),與健康豬血液及豬常見細(xì)菌、病毒病無交叉反應(yīng);敏感性高,可檢測出18fg弓形蟲基因組。

2.5 實時定量PCR 實時定量PCR(real-time quantitative PCR)是一種將探針技術(shù)和PCR技術(shù)結(jié)合起來進(jìn)行準(zhǔn)確定量的PCR方法,可通過PCR擴(kuò)增后的DNA產(chǎn)物含量來推算原來標(biāo)本中特定DNA或mRNA的含量。因探針常用熒光物質(zhì)標(biāo)記,所以又稱熒光定量PCR。王頻佳等〔13〕以弓形蟲529 bp重復(fù)序列部分片段構(gòu)建重組質(zhì)粒作為模板,建立熒光定量PCR。經(jīng)多組實驗得到Mg2+濃度1.5 mmol/L,引物濃度為 0.5 μ mol/L,探針濃度為1.0 μ mol/L的最佳反應(yīng)條件。用 104～1010拷貝/μ L的起始模板制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線循環(huán)閾值與模板濃度顯示出良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)0.995,平均試驗間變異系數(shù)為3.28%,且沒有非特異性擴(kuò)增。該方法檢測臨床標(biāo)本,陽性率為43.3%。

朱祥明等〔14〕以 B1基因建立弓形蟲 SYBRGreen1熒光定量PCR檢測方法,檢測弓形蟲B36蟲株為陽性,血吸蟲、惡性瘧原蟲為陰性,孕產(chǎn)婦檢測樣本陽性率達(dá) 16.7%,無償獻(xiàn)血者樣本為0.74%。Yang W 等〔15〕以B1基因和529 bp重復(fù)序列為目的基因設(shè)計引物建立的實時定量PCR,檢測水樣本中的弓形蟲卵囊,可達(dá)到檢測到1個弓形蟲卵囊的靈敏度。Wallon等〔16〕用該方法對不同懷孕期婦女羊水進(jìn)行弓形蟲檢查,準(zhǔn)確率為100%。

3 環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)

環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是 Notomi等〔17〕于 2000年開發(fā)的一種等溫核酸擴(kuò)增方法。其特點是設(shè)計4條引物,結(jié)合目的基因的6個特異性區(qū)域,在具有自主鏈置換活性的Bst DNA聚合酶的作用下,恒溫65 ℃作用30 min～1 h即可擴(kuò)增109～1010倍,完成反應(yīng)。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳呈典型的階梯式條帶,而且在反應(yīng)過程中,能產(chǎn)生肉眼可見的焦磷酸鎂白色沉淀,使基因擴(kuò)增和產(chǎn)物檢測可一步完成。反應(yīng)中不需要對模板熱變性以及長時間的溫度循環(huán),因此不需要昂貴的儀器設(shè)備,普通的加熱裝置即可。該檢測方法速度快,操作簡便,結(jié)果觀察容易,非常適合于在小型實驗室和基層單位推廣。

Sotiriadou等〔18〕根據(jù)弓形蟲 TgOWP 和B1基因建立了 LAMP方法,以檢測水中弓形蟲。用LAMP與套式PCR同時檢測26個弓形蟲陽性水樣,LAMP檢出率為100%,而套式PCR為53.8%。另用LAMP、PCR和免疫熒光試驗(IF T)分別檢測52個來自不同地區(qū)的自然水樣,結(jié)果弓形蟲檢出率LAMP為48%,套式 PCR為 13.5%,而 IFT結(jié)果全陰性。通過對比實驗發(fā)現(xiàn),LAMP能夠快速、特異且敏感地檢測水樣中弓形蟲污染。Zhang等〔19〕根據(jù)弓形蟲529 bp重復(fù)序列建立LAMP方法,與常規(guī)PCR方法同時對疑似感染弓形蟲豬的淋巴結(jié)進(jìn)行檢測,結(jié)果 LAMP陽性率為85.7%,而常規(guī)PCR陽性率為76.9%,說明LAMP方法可作為家畜弓形蟲病的分子診斷工具。Krasteva等〔20〕利用弓形蟲單一拷貝的SAG1基因設(shè)計引物建立了LAMP診斷方法,對人工感染弓形蟲小鼠的不同組織樣本進(jìn)行弓形蟲檢測,并與常規(guī)PCR方法進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)其靈敏度明顯高于常規(guī)PCR。在我國,楊秋林等〔21〕根據(jù) B1 基因 ,劉郎等〔22〕根據(jù) 529 bp 重復(fù)序列建立了弓形蟲 LAMP檢測方法。結(jié)果均顯示LAMP在弓形蟲檢測中有良好的特異性與敏感性。

4 DNA微陣列

DNA微陣列(DNA microarray)是在DNA雜交測序芯片的基礎(chǔ)上,經(jīng)改良發(fā)展出來的一種分離、檢測基因的方法,簡稱基因芯片(gene chip)技術(shù)。該技術(shù)自1989年提出以來,人們對它的研究一直方興未艾。該技術(shù)是將大量DNA片段按特定排列方式固定于尼龍膜、玻璃、硅片等載體上,形成致密有序的分子點陣,與熒光素等標(biāo)記的探針分子在同一條件下進(jìn)行核酸雜交,經(jīng)共聚焦激光掃描儀掃描,利用數(shù)據(jù)分析軟件獲得雜交結(jié)果。具有高通量,平行性的特點,可同時對多種疾病進(jìn)行檢測。該技術(shù)已在弓形蟲致病機(jī)理,分析其感染過程宿主基因表達(dá)譜等基礎(chǔ)研究中廣泛應(yīng)用〔23-24〕。Odenthal等〔25〕以68個淋巴腺炎病人的石蠟包被的病料作為核酸樣品來源,經(jīng)套式PCR與多重PCR鑒定病原后,建立了低密度微陣列(low-density microarray)。結(jié)合多重PCR制備的探針,可檢測出包括弓形蟲、分枝桿菌、耶爾森氏菌等在內(nèi)的多種病原。結(jié)果顯示出了較強(qiáng)的特異性與可重復(fù)性,可以靈敏地同時檢測多種病原。

5 總結(jié)與展望

綜上所述,基于遺傳標(biāo)記的分子生物學(xué)診斷技術(shù)為弓形蟲病的診斷提供了非常有效的檢測手段。分子生物學(xué)診斷技術(shù)較傳統(tǒng)病原學(xué)檢測具有檢測速度快,檢出率高等優(yōu)點,大大減少了漏檢的現(xiàn)象;與免疫學(xué)檢測相比,避免了因疫苗免疫或一過性患病而產(chǎn)生抗體的假陽性的結(jié)果。雖然各種分子生物學(xué)診斷技術(shù)都有一定局限性,但特異性強(qiáng)和敏感性高的優(yōu)點仍顯示出良好的應(yīng)用前景。因此,簡單、靈敏、快速的分子生物學(xué)診斷技術(shù),對于弓形蟲病的臨床診斷、進(jìn)出口檢疫和流行病學(xué)調(diào)查非常重要,是弓形蟲病診斷的發(fā)展趨勢。目前,國內(nèi)外均有弓形蟲病分子生物學(xué)診斷試劑盒申報專利,而不斷加大臨床樣本檢測數(shù),逐步完善試劑盒的相關(guān)指標(biāo),將此技術(shù)由實驗室推向基層,才是弓形蟲病分子生物學(xué)診斷技術(shù)發(fā)展的最終目標(biāo)。相信隨著分子生物學(xué)的進(jìn)一步發(fā)展和對弓形蟲基因功能研究的深入,必將開發(fā)出更加特異、敏感的檢測方法,從而達(dá)到快速、準(zhǔn)確診斷弓形蟲病的目的。

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