牛膝應用于大鼠同種異體肢體移植抗排斥反應的研究

馮磊 張震宇 谷文光

(1.齊齊哈爾市第一醫院 黑龍江齊齊哈爾 161000; 2.哈爾濱醫科大學第一附屬醫院 黑龍江哈爾濱 150000)

牛膝具有明顯的免疫抑制作用,已被廣泛認可,但其發揮免疫抑制功能的作用機制,并為完全明了,有大量實驗研究表明,牛膝抗排斥反應的作用途徑是多方面、多角度的。在免疫細胞水平的抑制作用,可明顯抑制T、B淋巴細胞的轉運功能,對巨噬細胞和NK細胞都有一定抑制作用。在免疫分子水平的抑制作用,通過抑制IL～2、IL～6的分泌,從而對細胞毒T細胞的產生和成熟形成有一定的抑制作用,影響其對靶細胞的殺傷能力。其他途徑,可以抑制細胞毒T淋巴細胞的功能,減弱其釋放穿孔素和顆粒酶B的表達能力,從而影響CTL細胞對靶細胞的殺傷。

1 資料與方法

1.1 一般資料

受供者分別為10～12周齡清潔及純系健康雄性Wistar大鼠、SD大鼠,體重200～250g,購自哈爾濱醫科大學附屬第一醫院實驗動物中心和北京維通利華公司,實驗動物均在清潔級條件下喂養。

1.2 實驗方法

牛膝水提取物的制備由哈爾濱醫科大學附屬第一醫院藥劑局協助完成。將牛膝粉碎后加雙蒸水浸泡,煮沸3次,合并3次藥液放入4℃冰箱中過夜,以3000r/min 離心30min取上清液用雙蒸水稀釋。

1.3 實驗分組

雄性Wistar大鼠及雄性SD大鼠各27只。隨機分成3組,每組各9只。SD大鼠為受體,Wistar大鼠為供體。實驗分為3組,每組9只。移植肢體術后2d內死亡的認為發生手術并發癥,不進入實驗觀察,另行手術補充。A組(牛膝組):將牛膝水化稀釋為0.25g/mL,術后術后當日起每隔1d天灌服1次,劑量為5mg/kg。B組(對照組):術后不用免疫抑制劑,僅應用生理鹽水10mL/kg·d-1灌服。C組(環孢素A,CsA)組:術后將CsA用生理鹽水稀釋為1mg/mL,術后當日起每隔1d灌服1次,劑量為5mg/kg。

1.4 檢測指標

1.4.1 一般指標 觀察項目包括大鼠的活躍程度、飲食、大小便、生命體征、皮膚、體毛、傷口有無分泌物、紅腫;移植物的血循、顏色、溫度、腫脹程度、體毛的變化、皮膚水皰、滲出、潰瘍、糜爛、焦痂、足趾變黑壞死等,詳細記錄各種變化的時間及情況。

1.4.2 急性排斥反應的觀測 根據異體移植肢體的血運變化和皮膚表現,觀察各組移植肢體急性排斥反應的發生時間和移植肢體存活時間,其中急性排斥反應的發生時間嚴格限定在移植肢體皮膚出現紅斑水腫持續24h,移植肢體壞死標準為皮膚脫落或出現干性壞疽。

1.4.3 移植肢體組織的光鏡標本制備及觀察 于術后1、3、5、7d切取異體移植肢體包括皮膚、脛前肌、骨、坐骨神經、脛前血管的組織塊,消毒縫合切口。用10%甲醛固定,常規方法制備樣本。

2 病理學診斷和分級

并根據Lee和Buttermeyer推薦的移植物排斥反應標準進行分級0級為無排斥,各組織正常,無炎性細胞浸潤;I級為輕度排斥,血管周圍及骨骼肌間質內局灶性炎性細胞浸潤,皮膚基底層細胞空泡化;II級為中度排斥,血管周圍及骨骼肌間質內多灶性炎性細胞浸潤,皮膚上基底層細胞大泡形成;III級為重度排斥,彌漫性多類型炎性細胞浸潤,伴有各組織明顯的出血、水腫、脈管炎、壞死或纖維化。因為皮膚的排斥反應最強,所以本實驗統計每組皮膚排斥反應的病理學分級平均值。CD4+、CD8+細胞檢測術后對各組模型行鼠尾取血,用流式細胞儀檢測T淋巴細胞亞群中CD4+、CD8+細胞的百分率及CD4+/CD8+的比值。

3 統計學方法

采用SPSS 13.0統計軟件進行單因素方差分析,進一步多重比較采用LSD-t檢驗。P<0.05認為差異有統計學意義。

4 結果

大鼠一般于手術后逐漸清醒,起初精神狀況較差,但可以飲水、行走、恢復大小便,術后當日基本上可以進食。1d后宿主的精神狀況、飲食、大小便、生命體征基本恢復正常。

通過術后連續觀察發現,A、B組大鼠術后1～2d移植肢體皮溫較健側肢體稍高,移植物腫脹較輕,血運良好。術后3～4d開始,移植物開始腫脹,先是移植物的上端和足背部,然后迅速加重和擴展,5～6d左右皮膚變濕,7～8d左右肢體毛發開始脫落,皮膚出現紅斑并伴糜爛以大腿的內上側出現最早,9～13d整個移植物變黑壞死。C組大鼠術后移植肢體也輕度腫脹,于術后8～9d天腫脹開始明顯,最終于14～19d移植物變黑壞死。A組排斥反應時間(9.62±2.37),肢體平均存活時間（16.11±1.72）;B組排斥反應時間(7.13±1.37),肢體平均存活時間(11.14±1.31);C組排斥反應時間(13.71±2.48),肢體平均存活時間(21.32±1.53)。

5 討論

同種異體移植排斥反應的本質就是免疫應答過程,都要經過抗原識別、免疫細胞活化分化和效應階段[1]。有結果顯示,同種異體移植排斥反應和常規免疫應答的不同之處主要在于抗原識別和效應階段。同種異體組織器官移植后,發生急性排斥反應時CD4+T細胞升高,CD8+細胞下降及CD4+/CD8+的比值升高。本實驗應用牛膝后,CD4+、CD4+/CD8+的比值明顯降低,CD8+明顯增高,有延長移植物存活時間和動物模型存活時間的作用,有力的證實了牛膝具有明顯抑制排斥反應的作用。綜上所述,大量實驗已證明牛膝在抗排斥反應有明顯的作用,但其具體明確的抑制途徑和副作用,還需要進一步的實驗研究證實,盡管需要解決的問題不少,但我們相信,隨著各種相關研究的深入,中藥免疫抑制劑的基礎研究,以及未來的臨床應用將會有廣闊的前景,因此,隨著實驗技術的提高,中藥免疫抑制劑作用機制會得到充分的揭示。相信不久的將來中藥免疫抑制劑在臨床的應用將造福于人類。

[1]陳宗鍇,李電東.牛膝多糖的免疫調節作用[J].藥學學報,1997,32(12):881～887.