高遷移率族蛋白B1及其受體在炎癥發生中的作用機制研究

趙龍軍 靳衛國

1 泰山醫學院研究生部（271000）

2 聊城市人民醫院婦產科（252000）

高遷移率族蛋白（high mobility group protein，HMG） 是一大類富含電荷的低分子非組蛋白染色體核蛋白，因其在聚丙烯酰胺凝膠電泳中的高遷移能力而得名，HMGB1屬于HMG家族成員之一，廣泛存在于各種細胞中，人HMGB1基因定位于染色體13q12，在進化過程中高度保守，含215個氨基酸殘基，N端富含賴氨酸，酸性尾端富含天冬氨酸和谷氨酸，2個 “L”型HMG box，分別是A box（1～85個殘基）和B box（88～162個殘基），是結合DNA的功能結構域，與酸性尾端共同組成3個功能區。而B box具有細胞因子樣活性，誘導炎性細胞分泌促炎性細胞因子，這種細胞因子樣活性會被A box對抗。HMGB1與DNA的結合非常松散，經常通過核孔游走于細胞核和細胞質之間，參與DNA的復制、轉錄及修飾過程，有“DNA伴侶”之稱，近年來的研究證實HMGB1在急慢性炎癥中均具有表達，特別是遲發型的炎性反應。

1 HMGB1的產生

最初的研究表明，內毒素可刺激巨噬細胞產生HMGB1，且持續時間較長，其后發現多種促炎性因子如TNF-α、IL-1等均可誘導巨噬細胞/單核細胞分泌HMGB1[1]，并使HMGB1分子上的賴氨酸殘基乙酰化，而HMGB1的乙酰化會導致核孔堵塞，使HMGB1在細胞質內聚集，不能再進入核內，含有HMGB1的分泌性溶酶體與細胞膜融合，活化后即被分泌。另外，內皮細胞在LPS和TNF-α刺激下能分泌HMGB1，壞死細胞可釋放HMGBl。

2 HMGB1的受體

晚期糖基化終產物受體（receptor for advanced glycation end products，RAGE）是一種膜受體，由400多個氨基酸組成，包括一個“V”樣域和2個“C”樣域，每個都含有一對保守的半胱氨酸殘基，“V”樣域上還含有2個與“N”耦連的糖基化位點，這些對于RAGE分子結構的穩定性和特異識別配體的功能具有重要意義，RAGE的胞內域主要與信號轉導有關。RAGE是HMGB1的主要受體，在正常組織中RAGE低表達[2]，在T細胞、樹突狀細胞（DC）、巨噬細胞等炎性細胞中高表達，多數研究表明HMGB1的促炎效應大部分是通過RAGE起作用的。

3 HMGB1介導的信號轉導通路

對HMGB1作用的信號通路的研究集中在核轉錄因子NF-κB[3,4]和MAPK信號轉導途徑兩個方面，其中MAPK信號通路最終通過活化NF-κB起作用。

3.1 NF-κB信號轉導通路

核因子κB（NF-κB）是Sen等于1986年從B細胞核提取物中發現的一種能與免疫球蛋白κ輕鏈的增強子κB序列特異結合的蛋白因子。在大多數細胞中，NF-κB與其抑制蛋白IκB家族成員結合，以無活性的方式存在于胞質中。當HMGB1與RAGE結合后，誘導發生氧化應激，產生大量氧自由基，進而激活IκB激酶，使IκB磷酸化，與NF-κB解離，使NF-κB具有活性[5]。NF-κB可與TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8等多種細胞因子的基因啟動子或增強子發生特異性結合，促進基因轉錄和表達，而其靶基因產物（如TNF-α和IL-1β）可正反饋激活NF-κB，誘發級聯放大效應。

TNF-α與其受體TNF-R1結合，引起TNF-R1的三聚化，形成同源三聚體，通過同嗜性募集TRADD（含有死亡結構域），TRADD再與TRAF2（TNF受體相關因子2）、絲氨酸/蘇氨酸磷酸化激酶RIP（receptor interacting protein）受體相互作用蛋白結合向細胞膜移動，發生多聚化，從而激活IκB激酶，活化NF-κB。在這個級聯反應中，RIP起主要作用，TRAF2有協同作用[6]。IL-1與IL-1R結合后，活化的IL-1R與IL-1受體結合蛋白（IL-1RacP）形成復合物，通過接頭蛋白MyD88與下游絲氨酸/蘇氨酸磷酸化激酶IRAK/IRAK2作用，進而與泛素連接酶TRAF6相互作用，促進MEKK1活化，進而激活IκB激酶，參與NF-κB的活化[5]。

3.2 MAPK信號轉導通路

絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）是生物體內重要的信號轉導系統，能被多種炎性刺激所激活，并對炎癥的發生、發展起重要調控作用。HMGB1與其受體RAGE的結合引發RAGE胞內結構域變構，誘發氧化應激反應，產生的氧自由基會激活Ras，進而磷酸化MEK1，這種磷酸化是雙重的，大大增加了MEK1的活性，具有活性的MEK1作用于下游底物MAPK/ERK，使其具有活性，影響細胞因子、趨化因子、黏附因子等的基因轉錄和表達。在這個通路中，MAPK除有自身的生理病理作用外，還可以通過激活NF-κB起作用[7]。

3.3 HMGB1與TLRs結合后的信號轉導

TLRs是一種Ⅰ型跨膜蛋白，由緊密相連的3個部分組成，其中胞內段被稱為TIR區，為所有 TLR及IL-1R分子胞內段所共有。該結構域可以與胞內其他帶有相同TIR結構域的分子發生相互作用，啟動信號傳遞，是信號轉導的主要區域。HMGB1與TLRs的研究目前主要集中在TLR2、TLR4和TLR9上。TLRs識別上述相應 PAMPs及內源性配體后，與胞質區內不同的受體接頭蛋白結合進行信號轉導。大都通過MyD88依賴性途徑，介導下游的信號轉導。MyD88為TLRs信號途徑中普遍存在的接頭分子，它的C端含 TIR結構域，與TILRs胞內區的TIR結合，N端則是死亡結構域。在信號轉導過程中，MyD88一方面可通過C末端的TIR區域與TLR的TIR區直接相連，同時又可通過N末端區與IL-1受體相關激酶（IRAK）相互作用，形成TLR-MyD88-IRAK受體復合物，使信號下傳，可激活NF-κB和AP-1，控制炎性因子的分泌[8]。其通路主要有以下兩條：①TIR-MyD88/IRAK-NF-κB誘導激酶 （NIK）/NF-κB途徑；②TLR -MyD88/IRAK絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）途徑。

4 HMGB1與免疫細胞

4.1 HMGB1與T淋巴細胞

T細胞介導的細胞免疫在機體的炎性反應中有著舉足輕重的作用，研究表明HMGB1可以介導T細胞向各個亞群的分化，并呈現出劑量依賴關系[9]。后來進一步的研究表明了低劑量HMGB1可增強淋巴細胞免疫功能，表現為Th1、Tc1占優勢，同時會對淋巴細胞 IL-2分泌有促進作用，而大量產生的IL-2將促使 Th0、Th2及 Tc0、Tc2 向Th1、Tc1漂移，同時，Th1和Tc1亞群增加會促進IL-2產生，將在一定范圍內形成正反饋[10]。調節性T細胞（Treg）可誘導自然殺傷性T細胞（NK細胞）、B細胞凋亡，下調樹突狀細胞表面分子CD80/CD86表達，抑制CD4+、CD8+功能等。CTLA-4是公認的T細胞表面介導接觸抑制的重要膜分子。已有多項研究表明，阻斷 CTLA-4或其Fab段分子能夠明顯逆轉CD4+CD25+Treg的抑制效應。同時，特異性表達于CD4+CD25+Treg上的 Foxp3，其基因及蛋白產物的表達狀況直接影響著Treg表型及功能活性發揮[11]。研究表明，HMGB1能誘導Treg CTLA-4表達弱，HMGB1可能通過下調 Foxp3表達進而影響Treg免疫調節活性，這種關系呈現出了時間-效應關系和劑量-效應[12]。

4.2 HMGB1與巨噬細胞

Andersson等[13]研究證實了HMGB1可誘導單核/巨噬細胞產生多種炎性因子，如TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8和巨噬細胞炎性蛋白1等，作用于內皮細胞后可促進細胞間黏附分子1、血管細胞間黏附分子1的表達，并可增加平滑肌細胞的細胞骨架重構及趨化，是感染、損傷和炎癥中關鍵的晚期因子。劉峰等[14]研究了HMGB1對離體小鼠腹腔巨噬細胞免疫活性的影響，通過對巨噬細胞的吞噬功能、殺傷活性、趨化活性及抗原呈遞能力的研究證實，一定濃度的HMGB1可增強巨噬細胞的免疫功能，這種效應呈現出了劑量效應關系，與時間的關系呈現出拋物線樣關系，這樣的效應同是提示了HMGB1對巨噬細胞的免疫功能可能存在雙向調節效應，高濃度HMGB1刺激后正向調節作用有所抑制。后續研究了HMGB1對巨噬細胞免疫功能影響的可能受體機制，通過分離培養小鼠腹腔巨噬細胞，HMGB1刺激后，采用激光掃描共聚焦顯微鏡和流式細胞術檢測RAGE的表達，結果證實HMGB1可誘導RAGE表達增強[15]。巨噬細胞能否提呈抗原以及提呈抗原作用的強弱與I-A/-E抗原表達直接相關，低劑量HMGB1攻擊上調巨噬細胞I-A/-E的表達，究其原因可能與大劑量 HMGB1下調巨噬細胞MHC-Ⅱ類分子表達，而適度 HMGB1負載會增加IL-2的表達有關[16]。

4.3 HMGB1與樹突狀細胞

樹突狀細胞（dendritic ceils，DC）是迄今發現的功能最強的抗原遞呈細胞（APC），它作為免疫調節細胞既有免疫激活作用，又可誘導免疫耐受，并與其成熟發育狀況密切相關[17]。在未成熟 DC表面可表達低水平的 CD80、CD86和MHC-Ⅱ分子，MHC-Ⅱ分子與T細胞表面T細胞受體，CD80及CD86可與 T細胞表面的CD28相互作用，提供激活 T細胞的協同刺激信號。徐姍等[18]研究表明，HMGB1可促進大鼠脾臟DC細胞表面共刺激分子CD80、CD86和 MHC-Ⅱ的表達增強，證明HMGB1可直接誘導 DC發生病理生理改變。然而當 HMGB1刺激劑量進一步加大時，CD80、CD86和MHC-Ⅱ表達反而減弱，其確切原因尚不清楚，推測可能與HMGB1的毒性作用有關。另外發現HMGBl可以誘導 DC高表達共刺激分子，分泌IL-12、TNF-α，促使DC成熟。

4.4 HMGB1與血管內皮細胞

血管內皮細胞的損傷是許多疾病發病的重要環節。別良峰等[19]研究了HMGB1誘導血管內皮細胞分泌TNF-α的規律及其在膿毒癥中的作用，結果表明血管內皮細胞TNF-α的分泌與HMGB1刺激濃度間有顯著的劑量依賴性關系，并且HMGB1誘生TNF-α的動力學特點與LPS明顯不同，LPS刺激細胞后TNF-α的分泌呈一過性增高，而HMGB1誘生的TNF-α則隨著時間的增加而增加，呈時間依賴性。血管內皮細胞在HMGB1的刺激下，能誘導黏附分子的表達，如ICAM-1、VCAM-1等，還能刺激TNF-α、IL-8、MCP-1、PAI-1、t-PA等因子的產生。由血管內皮細胞不是免疫系統中的成員，但其介導的免疫反應和對細胞因子的釋放的影響具有舉足輕重的作用。

總之，作為晚期致炎細胞因子，HMGB1參與了許多炎癥性疾病的病理生過程，具體的作用機制有待于深入研究。另外，研究證實HMGB1單克隆抗體以及水楊酸鈉、丙酮酸乙酯、尼古丁、溶血磷脂膽堿、重組HMGB1 A box蛋白等可抑制HMGB1的釋放或抑制HMGB1的作用，相信HMGB1的深入研究對炎癥疾病的治療會開辟新的途徑。

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