利用代謝工程技術提高工業微生物對脅迫的抗性

付瑞燕，李寅

1 安徽農業大學茶與食品科技學院，合肥 230061

2 中國科學院微生物研究所，北京 100101

利用代謝工程技術提高工業微生物對脅迫的抗性

付瑞燕1，李寅2

1 安徽農業大學茶與食品科技學院，合肥 230061

2 中國科學院微生物研究所，北京 100101

代謝工程是工業微生物菌種改造的平臺技術，不僅可用于改變微生物細胞內的代謝流向，也可以用于改善工業微生物的生理功能。在工業生產過程中，微生物細胞會面臨多種脅迫作用，這些脅迫誘導的基因調節作用，都有可能影響細胞的許多重要生理功能，從而影響生物轉化過程的效率。從工業應用的觀點出發，選擇生產性能良好、對發酵過程中的主要脅迫因素有較強耐受性的菌株至關重要。以下評述了借鑒傳統代謝工程技術和反向代謝工程技術來提高工業微生物對脅迫抗性的若干研究策略，提出了該領域目前存在的問題，以及利用代謝工程技術改善微生物脅迫抗性——即微生物生理功能工程的發展方向。

代謝工程，工業微生物，脅迫抗性，生理功能工程

隨著近年來代謝工程的迅猛發展，定向改變和優化微生物的生理功能即微生物生理功能工程也逐漸成為代謝工程的應用領域之一[1]，以下就近年來借鑒代謝工程技術的思想，提高工業微生物脅迫抗性相關領域的最新方法和策略的進展作簡要綜述。

1 借鑒傳統代謝工程技術構建脅迫抗性突變株

代謝工程發展早期，人們注重的是對生化和遺傳背景清楚的菌株，利用DNA重組技術對特定的代謝途徑進行目的性修飾、設計與構建，在相當程度上更側重于分子生物學技術的表現形式。在具體的實踐中，常采用的方法有：構建新的代謝途徑、拓展已有的代謝途徑和削弱已有的代謝途徑。構建新的代謝途徑是指引入外源抗性基因來改造和修飾代謝網絡，使細胞從不能合成某種代謝產物轉變為能夠合成此代謝產物。拓展已有的代謝途徑是指通過基因工程手段引入外源基因，使原有代謝途徑進一步向前或向后延伸，從而與相關的代謝途徑相連，組成完整有效的抗脅迫途徑。削弱已有的代謝途徑是指通過抑制內源性基因的表達或敲除內源性基因，降低細胞中已有代謝途徑的流量。已有的研究表明，借鑒上述這 3種傳統代謝工程手段都可以提高微生物對脅迫的抗性。

1.1 構建新的代謝途徑合成脅迫抗性物質

乳酸乳球菌是乳球菌屬最重要和最典型的一個種。一直以來，乳酸乳球菌被人們用來作為乳制品發酵劑，如今又被發展成為生產食品級代謝產物的超級“細胞工廠”[5]，是原核細菌中一種重要的工業微生物。乳酸乳球菌的生長依靠發酵產能，不需要氧的參與。并且，乳酸乳球菌缺乏高效的抗氧脅迫系統，其好氧生長一般是弱于其靜置或厭氧生長的。有氧呼吸代謝產生的能量要遠遠高出發酵產能，因此，當乳酸乳球菌作為宿主來生產外源基因產物時，較低生物量和較長發酵周期必然會影響生產強度。提高對氧的耐受性是工業生產對乳酸乳球菌提出的一個要求。

乳酸乳球菌的抗氧脅迫系統中沒有過氧化氫酶(Catalase，CAT)，但存在超氧化物歧化酶 (Superoxide dismutase，SOD)。SOD在清除超氧陰離子自由基時會產生 H2O2，且 H2O2往往會積累在乳酸乳球菌的發酵液中。H2O2不僅是酵解過程中多種酶的抑制劑，還會引發毒性更大的羥自由基的產生。所以，H2O2被認為是包括乳酸乳球菌在內的許多乳酸菌好氧代謝所產生的最重要的抑制性物質之一。絕大多數需氧微生物都含有CAT，CAT具有很高的轉換數，一個CAT分子可以每秒鐘將數百萬個H2O2分子轉化為水和氧氣，從而使細胞免于遭受H2O2的毒害，是細胞內H2O2代謝的關鍵酶。因此，將編碼CAT的外源基因導入乳酸乳球菌成為構建抗氧脅迫突變株的首選策略。Rochat等[6]從枯草芽胞桿菌中克隆編碼依賴血紅素的過氧化氫酶基因KatE，將其插入到乳酸乳球菌 NZ9000的 nisin啟動子和信號肽SPUsp45下，結果有活性的 KatE分泌到了發酵液中。在4 mmol/L H2O2處理乳酸乳球菌1 h的氧脅迫條件下，重組菌的存活率比對照 (不含 KatE基因)提高800倍，表明KatE賦予乳酸乳球菌更強的H2O2抗性。并且，重組菌在振蕩條件 (240 r/min) 下培養3 d的存活率是對照的160倍。這表明，通過構建新的代謝途徑合成 CAT可以有效地提高宿主菌乳酸乳球菌抵抗氧脅迫的能力。

1.2 拓展已有的代謝途徑組成完整有效的抗脅迫途徑

由γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶、谷胱甘肽合成酶、谷胱甘肽還原酶 (Glutathione reductase，GR)、谷胱甘肽過氧化物酶 (Glutathione peroxidase，GPx) 和NADPH組成的依賴于谷胱甘肽 (Glutathione，GSH)的GPx系統對于釀酒酵母細胞具有不可替代的抗氧化作用。乳酸乳球菌中存在 GR和依賴于 GSH的GPx。雖然乳酸乳球菌不能合成 GSH，但可以從培養基中吸收GSH，并且被乳酸乳球菌吸收到胞內的 GSH能夠提高細胞抵抗氧脅迫的能力。以上研究表明乳酸乳球菌中可能存在著一個不完整的抗氧脅迫途徑，因此，將GSH的合成代謝途徑導入乳酸乳球菌，有可能可以拓展已有的 GSH相關代謝途徑，從而構建出一條完整的依賴于GSH的抗氧脅迫防線。

作者以能夠生物合成 GSH的乳酸乳球菌NZ9000 (pNZ3203) 為實驗菌株，對GSH在乳酸乳球菌工程菌株抗氧脅迫的能力進行了研究[7]，結果表明GSH可以提高宿主菌NZ9000對較高H2O2脅迫劑量 (50 mmol/L H2O2，15 min) 和甲萘醌 (超氧陰離子自由基生成劑) 所引發氧脅迫的抗性。由此表明，通過代謝工程手段在乳酸乳球菌 NZ9000中引入GSH合成能力，可以顯著提高宿主菌對氧脅迫的抗性。

1.3 削弱已有的代謝途徑

釀酒酵母具有其他微生物所不具備的高乙醇耐受性，因此自古以來被廣泛地應用在乙醇生產中。但當釀酒酵母自身產生的乙醇達到一定濃度時，對它本身也會產生毒性。隨著乙醇濃度的增加，釀酒酵母的增殖速度及存活率下降，進一步提高乙醇的濃度，釀酒酵母的發酵會停止。因而關于釀酒酵母的乙醇耐受性的研究始終是酵母研究者關注的重要課題之一。

海藻糖 (Trehalose) 能提供微生物細胞碳源和能量，穩定細胞膜和蛋白質，保護細胞抵御脅迫。Jung等[8]根據釀酒酵母 ATH1 (編碼酸性海藻糖酶)基因序列，PCR擴增ATH1基因中+1~+500堿基序列的反義基因片段，分別與ADH1、CYC1和ATH1啟動子融合，插入到質粒中，再將重組質粒導入釀酒酵母。結果表明，含有ATH1反義基因的3株釀酒酵母重組菌中的酸性海藻糖酶表達水平均有所降低，其中重組質粒中啟動子為ADH1的釀酒酵母重組菌的下降幅度最大。進一步研究發現，與對照菌相比，釀酒酵母重組菌的乙醇產量更高，乙醇生成速率也更快。釀酒酵母重組菌在含有30%葡萄糖的YPD培養基中培養，乙醇產量達到最高所需的發酵時間從88 h縮短至44 h。在乙醇濃度為8%的脅迫條件下，與對照相比，重組菌生長速率快；并且，生長8 h后，重組菌的存活率是對照的1.5倍。以上研究表明抑制海藻糖酶的表達水平可以提高釀酒酵母對乙醇的抗性。

與乳酸乳球菌抗氧脅迫突變株相比，釀酒酵母乙醇脅迫突變株的構建效果并不理想，抗性提高幅度并不高。原因可能是目前對于釀酒酵母乙醇耐受機制還未深入了解，并且該脅迫是多基因參與的復雜脅迫過程[9]，因此瞄準個別基因的做法收效甚微。對于這類機制較復雜的脅迫過程，必須尋找到所有必要的脅迫相關基因，才有可能獲得優良的脅迫抗性突變株。

2 借鑒反向代謝工程技術構建脅迫抗性突變株

傳統代謝工程雖然在氨基酸、核苷酸等高產菌的選育中取得成功，但對單個代謝途徑進行改造，由于微生物代謝網絡的全局調控，往往并不能獲得預期的效果。基因組學和功能基因組學的發展，提供了從全局規模上深刻認識微生物生理和代謝特性的工具，從而推動了一種新的代謝工程設計策略——反向代謝工程。如前所述，生理功能工程特別是脅迫生理功能的改造也遇到了類似的困難，因此，反向生理功能工程策略也應運而生[1]。反向生理功能工程可以在對脅迫機理沒有充分了解的基礎上，直接找出所希望表型的關鍵基因，為構建特定微生物的脅迫突變株提供靶基因。目前，反向生理功能工程的研究主要借鑒反向代謝工程的手段來進行，其基本研究步驟主要由以下3個方面組成：

2.1 在異源微生物或相關模型系統中獲得預期的表型

應用反向生理功能工程，第一步是獲得預期的表型。目前可以采用的方法有結合高通量篩選方法的傳統誘變技術、全轉錄工程 (Global transcription machinery engineering，gTME) 和基因組重排 (Genome shuffling) 等。

傳統的誘變技術是一個行之有效的優良菌株的選育技術，借助高通量的檢測手段，可以快速有效地從由化學誘變劑誘變過的突變群體中篩選出預期表型，如Klein-Marcuschamer等[10]用小劑量NTG (致死率40%~50%) 誘變植物乳桿菌野生菌株，先后以pH為4.6±0.05 (用質量濃度為5.5 g/L的L-乳酸調節)或pH為3.85±0.05 (用HCl調節) 為篩選條件獲得耐受乳酸和低pH值的突變群體，繼代培養2次，隨后涂布平板以分離單菌落。將分離出的菌株以相同的起始OD值接種在96孔板中，在蘋果酸終濃度為100 mmol/L (pH為4.0±0.1) 的脅迫條件下培養，以低于10%的選出率高通量免搖瓶篩選出了穩定期OD值 (30~40 h) 高于野生菌株的酸脅迫抗性突變株。然而同樣條件下用gTME法獲得的酸脅迫抗性突變株選出率高于25%。為探究此結果背后的原因，進一步作了深入研究。將用2種方法所獲得的突變株庫液體培養后高倍稀釋涂布在96孔板上，以獲得單菌落。在固體培養基中添加終濃度為900 mmol/L的NaCl、60 mmol/L的HCl和4 g/L的L-乳酸作為脅迫因子，培養后平板放置在 4℃下過夜以使細胞停止生長，再用高性能圖像分析系統 AlphaImager 3400 System定量分析菌落生長速率。結果表明，用NTG誘變獲得的突變株庫表型分離度顯著低于用gTME獲得的突變株庫，從而脅迫抗性突變株的篩出機率也隨之降低。

基因的結構活化、轉錄起始、轉錄后加工及轉運、mRNA降解、翻譯及翻譯后加工及蛋白質降解等均為基因表達調控的控制點。其中在轉錄起始水平上的調控是最為經濟有效的重要方式。gTME就是這樣一個基于轉錄起始水平上的調控方法，它通過使整個基因組的轉錄發生全局性改變，從而導致許多由多種基因控制的復雜的細胞表型得到改變，最終獲得需要的優良表型[11]。利用該方法獲得預期脅迫抗性突變株的基本程序為：首先通過突變幾個影響全局轉錄的關鍵蛋白來造成多基因轉錄水平的改變，篩選出脅迫抗性突變株，然后通過比較出發菌株和突變菌株的轉錄譜，得到與某一脅迫抗性表型相關的基因。原核生物和真核生物的轉錄機制不同，因而可以在轉錄水平上對細胞表型調控產生全局性擾動的關鍵蛋白也各不相同。

原核生物僅含有一種RNA聚合酶，可以直接起始轉錄合成RNA，通常由5個亞基組成，即σ、β、β'和2個α亞基，研究表明RNA聚合酶σ亞基和α亞基的突變可以提高大腸桿菌對脅迫的耐受性。例如，Alper等[12]通過對將大腸桿菌中編碼σ70因子的rpoD基因及其上游啟動子之間的序列進行幾輪易錯 PCR擴增，使大腸桿菌整個基因組的轉錄發生全局性改變，最終獲得了在高濃度乙醇環境下耐受能力大幅度提高的脅迫抗性突變株。Klein-Marcuschamer等[13]構建了大腸桿菌 RNA 聚合酶α亞基編碼基因(rpoA) 的突變株庫，結果表明，RNA聚合酶α亞基的突變有助于提高大腸桿菌對丁醇的耐受性。

真核生物有3種RNA聚合酶，分別催化不同類型RNA的合成，均不能獨立轉錄RNA，都必須在蛋白質轉錄因子的協助下才能進行RNA的轉錄。轉錄因子分為通用轉錄因子與序列特異的轉錄因子兩大類。前者因參與了幾乎所有基因的轉錄而得名，是RNA聚合酶結合啟動子所必需的一組因子，為所有mRNA轉錄起動共有，包括TFIIA、TFIIB、TFIID、TFIIE 以及 TFIIF 等成員。后者則為個別基因轉錄所必需，決定該基因的時間、空間特異性表達。Alper等[11]利用基于通用轉錄因子的gTME方法，運用易錯 PCR改變釀酒酵母中 RNA聚合酶Ⅱ轉錄因子TFIID中TATA盒結合蛋白SPT15和TATA盒結合蛋白相關因子TAF25的編碼基因，構建2個gTME突變文庫后轉化入釀酒酵母中。通過在培養基中逐步提高乙醇和葡萄糖的濃度，篩選出了乙醇和葡萄糖耐受性提高的突變株spt15-300。與對照相比，突變株spt15-300 的生長性能顯著提高，對數期延長，生物量更高，乙醇產率也更高。可見，作為一種基于已有的基因知識來設計的代謝工程技術，gTME可以更理性地對工業微生物的表型進行優化。

利用基因組重組進行脅迫抗性突變株定向篩選的基本方法為：首先用傳統的誘變方法獲得一個突變株庫，篩選出若干脅迫抗性提高的突變株作為出發株，然后以多輪遞歸原生質體融合的方式使眾多基因隨機重組，最終從獲得的突變株庫中篩選出抗性顯著升高的突變株。克魯斯假絲酵母是一種極具潛力的燃料乙醇生產菌種。但是發酵副產物乙酸會抑制酵母細胞的生長和代謝，加劇乙醇對細胞的抑制作用。并且，乙酸普遍存在于木質纖維素水解產物中，因此，提高酵母對乙酸的耐受性是需要解決的一個重要問題。Wei等[14]利用紫外線誘變克魯斯假絲酵母 GL560的原生質體，隨后涂布在0.7%含乙酸的YPDK平板上，獲得了抗酸性能穩定提高的突變株。經過 4輪遞歸原生質體融合，最終篩選到了一個乙酸耐受性顯著提高的突變株S4-3。在乙酸體積濃度為0.5%的平板上，突變株S4-3的存活率是出發菌株GL560的30倍。進一步研究發現，突變株抗性提高的機制可能與細胞膜完整性和胞內CAT活性的提高有關。基因組重排技術不必了解菌株的遺傳特性，在細胞水平上即可進行定向進化，快速獲得具有優良表型的工業微生物，是一個十分有效的工具。如今，基因組重排的方法已成功應用于多種微生物的脅迫耐受性的改良方面[15-16]。

除了上述幾種成熟的方法外，近年來，核糖體工程 (Ribosome engineering) 和基因組多重自動修復技術 (Multiplex automated genome engineering，MAGE) 的研發也將為獲得理想突變表型提供可借鑒的方法。

在微生物細胞生長后期都會面臨營養物質缺乏、代謝產物積累的脅迫條件，此時的環境條件所引發的脅迫會抑制細胞的代謝活性，不利于生產強度的提高。核糖體是蛋白質的合成機器，也是細胞感知營養水平和對生長速率進行調控的重要位點[17]。研究表明，在生長后期，某些在生長前期沉默基因 (如編碼次級代謝產物的基因) 的激活表達與核糖體的功能密切相關，利用“核糖體工程”育種技術向微生物核糖體中引入特定的突變可獲得抗生素合成能力提高的突變株[18]。微生物可通過釋放和感知信號分子控制基因表達以適應環境。例如，多種桿菌屬所產生的氨基糖類抗生素 NTD (Neotrehalosadiamine) 就是一種稱為自誘導物的信號分子，可誘導基因glcP(特異性控制細胞對葡萄糖的吸收)表達水平顯著上調[19]，表明 NTD可通過加強營養的吸收來幫助產生菌在惡劣的環境中生存，事實上，這也是選育抗營養脅迫突變株的一種嘗試。因此，預期核糖體工程在獲得抗營養脅迫突變株方面會有重要應用。

近來，《Nature》雜志報道了一種稱為基因組多重自動修復技術的高速獲得理想細胞表型的新方法[20]。Wang等[20]從大腸桿菌的4 500個基因中選取了有可能改善番茄紅素生物合成能力的24個基因，將它們的DNA序列分割成易于處理的90個字母的片段，進行基因修飾后，每個片段都攜帶了單一的突變。利用這些特定序列，研究人員制成數千個獨特的基因結構，通過電轉化，將它們重新插回細胞。通過加速重組，研究小組在 3 d內創造出多達 150億個基因突變體，并使番茄紅素的產量提高了5倍，而用傳統的克隆技術產生 150億個突變需要花費數年時間。美國加利福尼亞大學洛杉磯分校的生物工程學家Liao指出：“這是一種普遍適用的方法”。因此有理由相信，隨著人們對脅迫抗性相關基因的發現，利用MAGE平臺將有力助推工業微生物脅迫抗性突變株的構建。

2.2 確定導致這一表型的遺傳基因

應用反向生理功能工程，第二步是快速找出突變表型所對應的基因型。目前可以采用的技術包括“組學”技術、人工轉錄因子工程 (Artificial transcription factor engineering) 和文庫富集尺度分析技術 (Scalar analysis of library enrichments，SCALEs) 等。

“組學”技術 (基因組學、轉錄組學、蛋白質組學、代謝物組學、代謝通量組學等) 在表型表征中起著極為重要的作用。例如，Hirasawa等[21]利用基因微陣列技術，在乙醇體積濃度為5%的條件下，對一株具有較高乙醇脅迫抗性的工業菌株釀酒酵母IFO2347和一株實驗室菌株釀酒酵母FY834進行基因表達譜的描繪。隨后對基因微陣列數據進行聚類分析，將目的基因的搜索范圍從 6 000個基因降至400個基因。構建了這 400個基因的缺失突變株，測定所有突變株對乙醇脅迫體積濃度為 5%時的敏感度，最終找出色氨酸合成基因可能是與乙醇脅迫抗性密切相關的基因。向培養基中添加色氨酸、過量表達色氨酸透性酶基因，均能增加酵母細胞對乙醇脅迫的抗性。并且，過量表達色氨酸合成基因的FY834突變株，對乙醇脅迫的抗性與菌株 IFO2347相當。這些進一步的研究結果驗證了預測的正確性。這是基于“轉錄組”的代謝工程。

然而，細胞的生理功能是許許多多基因產品(mRNA、蛋白質、代謝物) 共同參與的網絡信息調控的結果，比如，基因表達不僅僅是從轉錄組到蛋白質組的單向流動，表達的蛋白質或者是細胞生化狀態下其他的變化也會對轉錄組本身進行反饋控制，因而廣泛的基因分析應該建立在基因產品的全部水平上，才能對細胞的響應有更好的理解。為此，不同“組學”技術的組合越來越多地應用在代謝工程中。例如，丁醇是一種重要的化工原料和極具潛力的新型生物燃料，然而丁醇對細胞具有高毒害性導致丁醇產量不高，這是發酵法生產丁醇的一個關鍵限制因素。Rutherford等[22]對大腸桿菌的蛋白質組、轉錄組和代謝物組進行了分析，以綜合理解細胞對丁醇體積濃度為0.8%的脅迫環境的響應。結果表明丁醇脅迫會引發細胞呼吸功能的擾動、氧脅迫、熱休克和胞外被膜應激反應 (Cell envelope stress)，因而很難通過敲除或引入某個基因來顯著提高對丁醇脅迫的抗性。進一步對高通量組學分析技術得出的數據進行整合，鑒定出了很多關鍵的基因靶點，從而為代謝工程進一步改造菌種提供了依據。例如候選基因malE、yqhD和ompF，通過構建相應的缺失突變株，證實這些突變株對丁醇的敏感性增加，表明有可能通過過量表達這些基因來減輕丁醇對細胞的毒害。

“組學”技術只能分析表型對應的基因型，而人工轉錄因子工程和文庫富集尺度分析技術可以將獲得期望表型和尋找基因型的過程“合二為一”，在創造新的基因型的同時較為精準地定位靶基因。

天然的序列特異轉錄因子通常由 DNA結合結構域與效應結構域兩部分構成。DNA結合結構域能夠特異地識別并且結合其對應的DNA序列，使該轉錄因子能夠定位到靶基因；效應結構域通常是一個激活因子或者抑制因子，能夠激活或者抑制靶基因的表達。研究發現，這 2個結構域是各自獨立起作用的，于是可以將不同的DNA結合結構域與效應結構域組合在一起，人為地構建具有新的序列特異性與作用效果的轉錄因子，即人工轉錄因子[23]。其中，構建特異性的 DNA結合域是成功構建特異性人工轉錄因子的核心工作。鋅指蛋白 (Zinc finger proteins，ZFPs) 以其小巧靈活、結構獨特常作為DNA結合域的首選結構。研究發現，ZFPs可以作為揭示特定表型與基因型之間關系的新工具。Park等[24]將源自酵母ZFP文庫中的三指和/或四指的ZFP編碼基因隨機重排，克隆入質粒載體pZL1，在大腸桿菌DH5α中表達，構建了一個ZFP文庫，在50℃下培養2 h，從1×107個轉化子中篩選出了23個存活細胞。從耐熱表型中分離鑒定出10種ZFP，對其中誘導宿主菌產生抗熱脅迫能力效果最好的T9 ZFP用定位突變法和染色質免疫沉淀實驗進一步研究，發現T9 ZFP通過與目標基因 ubiX (編碼輔酶 Q生物合成的基因) 結合，導致靶基因表達水平下調而增強細胞的耐熱性，接下來的 ubiX敲除實驗結果也證實了這一點。

Warnecke等[25]利用“文庫富集尺度分析”技術(圖1[26])，控制條件將大腸桿菌K12的基因組DNA切割成精確界定大小的片段，并與質粒載體pSMART-LCKAN重組后導入大腸桿菌 Mach1-T1進行克隆，構建了大腸桿菌的基因文庫。通過逐步提高3-HP的濃度來營造脅迫環境，只有質粒中含有3-HP抗性基因的重組細胞才能存活下來。抽提質粒DNA，與基因芯片雜交，用SCALEs軟件定量分析4×105個菌落的高精度生長表型數據，利用已知的代謝網絡數據庫EcoCyc、COGs等分析基因-基因交互作用網絡 (Interaction networks)，計算途徑適應度和途徑頻度分析抗性細胞的代謝途徑，結果顯示通過確定受抑制的途徑 (分支酸和蘇氨酸途徑)，對這些途徑進行組合修飾可以顯著提高3-HP抗性 (最高可達 25倍)，效果遠遠優于對編碼個別酶的基因操作所達到的水平。

圖1 文庫富集尺度分析技術圖解Fig. 1 Overview of SCALEs, which was adapted from Fig. 1 of reference 26. a-b: genomic DNA from wild-type Escherichia coli K12 fragmented to several specific sizes was ligated into vectors creating several libraries with defined insert sizes; c: these libraries were individually transformed into E. coli strain Mach1-T1 used for selections. Each of these libraries each contained enough clones to ensure with >99% probability that the entire genome was represented; d: the pools of transformants were mixed and subjected to selection with decreasing concentrations of 3-HP. Only clones bearing plasmids with insert increasing fitness survive; e: enriched plasmids were purified from the selected population, prepared for hybridization to Affymetrix Genechips. SCALEs algorithm was then used to obtain high resolution growth phenotype data; f: genetic level fitness data were mapped according to various definitions of gene-gene interaction such as metabolic networks from EcoCyc, GOGs, etc.

2.3 通過遺傳改造使這一表型在特定微生物中表達

反向生理功能工程的最后一步是把鑒定出的目標基因導入特定微生物中，使目標菌株獲得所希望的理想表型。雖然這一研究策略在改造微生物的代謝能力方面已有許多成功的實例[27-28]，但是，在包括脅迫抗性在內的其他生理功能的改造方面至今還未見報道，這種狀況可能正說明反向代謝工程的研究策略并不能完全適用于反向生理功能工程。

3 存在的問題與展望

工業環境下的微生物總是面臨著不同種類的脅迫。要顯著提高工業微生物對生產環境下脅迫的適應能力，需要首先了解微生物應答不同脅迫條件的生理機制，在此基礎上才能發展出相應的方法，改善工業微生物細胞的生理功能。對于那些脅迫機理研究透徹，關鍵基因已經明確的脅迫生理響應過程來說，可以采用經典基因工程的方法，對個別基因/途徑進行改造。但經典基因工程的應用中也存在著問題，首先，基因的相互依存性會導致一個基因的表達不一定會帶來人們所預期的相關活性的產生，有時候還有可能會對細胞的代謝產生正效應或負效應。例如，在前期研究中，為改善乳酸乳球菌的生長性能，我們以輪枝鏈霉菌染色體DNA為模板，擴增得到編碼谷氨酰胺轉胺酶成熟酶的基因 mtg，將其克隆到乳酸乳球菌NZ9000，結果與對照菌 (不含mtg基因) 相比，重組菌不僅胞外pH 明顯升高，而且對氧的耐受性也得到顯著改善[29]。這種正效應表明mtg基因的導入對乳酸乳球菌的其他代謝途徑產生了較大的擾動，需要進一步研究代謝網絡及調控機理，驗證有關基因或途徑的功能，在此基礎上再進行合理設計，理性地構建脅迫抗性突變株。

其次，外源途徑的導入可能會打破宿主細胞的代謝平衡，對細胞產生毒害效應。例如，Martin等將異戊烯焦磷酸途徑導入大腸桿菌生產類異戊二烯，雖然重組菌的類異戊二烯產量較高，但細胞生長明顯受到了抑制。Piteraa等[30]采用基因滴度研究方法并結合液質聯用分析代謝物譜發現，其原因在于內源 HMG-CoA還原酶不足以平衡外源途徑的流量，導致中間產物HMG-CoA的積累使碳流量受限。通過調節HMG-CoA還原酶的產生，消除了此途徑“瓶頸”，結果類異戊二烯產量得到進一步提高。因此，當需要對某條途徑進行代謝工程改造時，可以利用前述的“精確調節表達工程”(Fine-tuning expression engineering) 在途徑表達和細胞活性方面尋求最佳平衡點[31]。

脅迫所引發的細胞內mRNA、蛋白質、代謝流的變化不是孤立存在而是相互聯系的，單一的“組學”分析不利于理解細胞對于突變的響應。如今，基于整體性研究為特點的系統生物學 (Systems biology)的系統代謝工程 (Systems metabolic engineering)已成為改造細胞復雜代謝調控網絡的有力研究工具，通過研究所有相關基因、蛋白質間的所有相互關系，正確選擇微生物遺傳選育的操作點，使微生物的菌種選育更具正突變性，這項技術已在過量生成代謝產物方面取得成功[32]。可以相信，系統代謝工程技術定會為微生物生理功能工程的發展帶來新的契機。隨著更多的重要工業微生物的基因組序列完成測序及“組學”技術研究的深入發展，以及計算生物學的發展，有望在不遠的將來，能夠利用多尺度多層次的微生物生理功能工程技術快速探明工業生產菌株的所有脅迫抗性關鍵基因，構建出更能適應工業生產條件的生產菌株。

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Improving industrial microbial stress resistance by metabolic engineering: a review

Ruiyan Fu1, and Yin Li2

1 School of Tea and Food Science, Anhui Agricultural University, Hefei 230061, China
2 Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China

Metabolic engineering is a technologic platform for industrial strain improvement and aims not only at modifying microbial metabolic fluxes, but also improving the physiological performance of industrial microbes. Microbes will meet multiple stresses in industrial processes. Consequently, elicited gene responses might result in a decrease in overall cell fitness and the efficiency of biotransformation. Thus, it is crucial to develop robust and productive microbial strains that can be integrated into industrial-scale bioprocesses. In this review, we focus on the progress of these novel methods and strategies for engineering stress-tolerance phenotypes referring to rational metabolic engineering and inverse metabolic engineering in recent years. In addition, we also address problems existing in this area and future research needs of microbial physiological functionality engineering.

metabolic engineering, industrial microbes, stress resistance, physiological functionality engineering

代謝工程是微生物菌種改造的平臺技術，它通過修飾和優化微生物代謝網絡與表達調控網絡，改善細胞的生理功能，從而將微生物改造成“細胞工廠”生產有用的物質，是一個極具吸引力的研究熱點。工業微生物的生理功能包括微生物的代謝能力、關鍵酶對終產物反饋抑制或阻遏的脫敏、惡劣環境下的魯棒性 (Robustness)、對高濃度底物或產物的耐受性、生產全過程的適合性 (Fitness) 等[1]。以往的代謝工程研究主要集中在改造微生物的代謝能力方面，而增強生物技術過程的產率及生產能力需要的不僅是定向改變代謝流的方向并使通量最大化，微生物的其他生理功能特別是脅迫抗性也需要改造。環境脅迫是指環境中不利于生物生長的因素。在工業生產過程中，微生物細胞會面臨多種因素的脅迫作用，包括酸脅迫[2]、高溫脅迫[3]、滲透壓脅迫[4]等。這些脅迫誘導的基因調節作用，都有可能影響細胞的許多重要生理功能，從而影響生物轉化過程的效率。因此，從工業應用的角度出發，開發出生產性能良好、對發酵過程中的主要脅迫因素有高耐受性的超能菌株至關重要。

February 27, 2010; Accepted: April 29, 2010

Supported by: National Basic Research and Development Program of China (973 Program) (No. 2007CB707803), Foundation of Human Resource of Anhui Agricultural University.

Yin Li. Tel: +86-10-64807485; E-mail: yli@im.ac.cn

國家重點基礎研究發展計劃 (973計劃) (No. 2007CB707803)，安徽農業大學穩定和引進人才科研資助項目資助。