工業微生物代謝途徑調控的基因敲除策略

于慧敏，馬玉超

1 清華大學化工系生物化工研究所，北京 100084

2 北京林業大學生物科學與技術學院，北京 100083

工業微生物代謝途徑調控的基因敲除策略

于慧敏1，馬玉超2

1 清華大學化工系生物化工研究所，北京 100084

2 北京林業大學生物科學與技術學院，北京 100083

基因敲除技術是一項重要的分子生物學技術，在工業微生物代謝工程中具有廣泛應用。以下從基因敲除技術的遺傳重組原理出發，總結了基因敲除策略的類型、特征和應用，重點介紹了采用線性雙鏈DNA的λ Red同源重組系統、使用環狀質粒載體介導的單交換或雙交換同源重組策略以及采用轉座酶介導的轉座重組等幾種主要的基因敲除方法，進一步展望了基因敲除技術的發展前沿和應用前景。

基因敲除，λ Red重組系統，單交換和雙交換，同源重組，轉座重組

簡單地說，代謝工程就是“一種理解并利用代謝過程的方法”[3]；具體而言，代謝工程就是利用基因工程技術或其他物理、化學方法對細胞的代謝途徑進行精確地修飾與改造，對細胞內目標物質的代謝流進行擴展、減小、阻斷或構建新的代謝途徑，從而有目的、有理性地改變微生物原有代謝特性，改進或者構建新的微生物表型，并與微生物基因調控、代謝調控及生化工程相結合，提高目的代謝產物活性或產量、或合成新的代謝產物的工程技術科學[1-2]。

由于生物系統的復雜性以及大量生物學數據的未知性，這種以理論為基礎的系統代謝工程方法的應用有時會受到限制。在此條件下，以基因組規模的分子生物學實驗工具為基礎的反向代謝工程方法進一步發展起來。反向代謝工程 (Inverse metabolic engineering，IME) 的概念最初由Jay Bailey于1996年提出[4]。首先，識別、構建或計算一種目標表型；其次，確定形成該表型的基因或環境因子；最后，通過直接的基因操作或環境調控將該表型轉而賦予其他菌株或生物體[5]。簡單而言，反向代謝工程就是從表型到基因型、再從基因型到表型的基因重組策略。

無論是代謝工程還是反向代謝工程研究，基因敲除都是代謝途徑調控的主要方法之一。基因敲除技術是20世紀80年代發展起來的一項重要的分子生物學技術，是通過一定的方法使細胞中特定的基因失活或缺失的技術。它具有定位性強、插入基因隨染色體 DNA穩定遺傳等優點。利用基因敲除技術，不僅可以研究被敲除基因的生物學功能，還可以進行功能基因的插入及染色體基因的替換，進而可以阻斷微生物細胞的代謝旁路，減弱毒/副作用，強化目標產物的產量或質量，從而成為具有重要工業應用價值的微生物細胞工廠研究中的重要內容。

1 基因敲除技術的基本原理

遺傳重組是指不同 DNA配對后的交換和重排過程[6]，包括同源重組、位點特異性重組和轉座重組 (或異常重組) 等。其中，同源重組是指兩個DNA分子之間，通過精確地相互交換片段達到序列重排的目的。通常意義上的基因敲除主要是應用 DNA同源重組 (Homologous recombination) 原理，利用限制性內切酶、連接酶以及PCR技術等對線性DNA片段或質粒等基因工程載體進行改造，并導入目標宿主中，使宿主完成對目的基因或基因簇的諸如片段缺失、插入突變、定點突變等一系列的修飾操作。

關于同源重組的分子機制，目前普遍接受的有3種模型，即 Holliday雙鏈侵入模型、Meselson-Radding單鏈侵入模型和 Szostak雙鏈斷裂修復模型[6-7]。其中，Holliday模型中提出的Holliday連接體 (Holliday junction) 結構是 3個模型所共有的重組中間體。越來越多的研究證明，這 3種模型實際上是相互聯系和相互補充的，而雙鏈斷裂引發的同源重組是生物體內更為普遍的遺傳現象[6]。

以大腸桿菌為例，大腸桿菌同源重組過程可分為 4個主要階段：起始、同源配對和鏈交換、異源雙鏈擴展 (分支遷移) 以及 Holliday連接體的解離[6-7]。在這一過程中，至少有 25種不同的蛋白質參與作用。其中，除最基本的 DNA解旋酶、DNA拓撲異構酶、DNA聚合酶、DNA連接酶等之外，具有特殊作用的包括RecBCD、RecA、SSB、RuvAB、RuvC以及順式作用重組熱點χ，也叫Chi位點等，最重要的是RecBCD和RecA蛋白。

同源重組的起始最突出的特點就是單鏈 DNA的產生，它是同源重組的底物。RecBCD酶是一種多功能的酶，它同時具有解旋酶、外切核酸酶、單鏈內切酶活性，并能以相當高的頻率啟動含有 Chi位點的DNA重組。Chi位點 (5′-GCTGGTGG-3′) 天然存在于大腸桿菌的染色體DNA中，約5 kb長的序列中出現一次。這些Chi位點與RecBCD酶作用，能夠促進具有3′-OH末端的單鏈DNA的產生。如圖1所示，由RecA蛋白促進的同源配對和鏈交換是同源重組的核心。RecA蛋白是單鏈結合蛋白，是同源重組過程中最重要的蛋白質之一，它大量地結合于單鏈DNA上 (SSB蛋白輔助)，并迅速啟動與之結合的單鏈DNA尋找同源雙鏈DNA，實現同源配對。該過程也稱為聯會 (Synapsis)。同源配對后，單鏈DNA便能侵入雙鏈DNA將其中的同源單鏈置換出來，自己與互補鏈進行堿基配對，并產生D-環，最終形成 Holliday連接體；繼而產生異構化，形成異源雙鏈。在RuvA、RuvB以及RuvC等蛋白的參與下，異源雙鏈的擴展以及 Holliday連接體的解離順利完成，通常會產生兩側基因有交換以及兩側基因無交換這兩種結果。

圖1 大腸桿菌同源重組過程中RecBCD、RecA和SSB蛋白的功能[8]Fig. 1 Function of RecBCD, RecA and SSB during the homologous recombination in Escherichia coli[8]. RecBCD enzyme has helicase and nuclease activities. Unwinding of DNA ahead of the moving RecBCD and slower rewinding behind create single-stranded bubbles. One strand is cleaved when the enzyme encounters a Chi site, forming a single-stranded tail. RecA and SSB coat the tail and promote invasion of another DNA duplex, initiating the homologous recombination.

經典的基因敲除策略正是利用上述同源重組基本原理，通過體外改造一定長度/形式的基因，與細胞染色體上的靶基因發生同源重組 (插入或置換)，從而改變細胞的遺傳特性。

2 基因敲除策略的類型、特征和應用

從上述同源重組的基本原理出發，分別針對同源重組的底物類型 (單鏈/雙鏈、線性/環狀)、重要蛋白 (RecA酶、RecBCD酶等及噬菌體中具有相似功能的酶) 和功能位點 (Chi位點) 等進行分子設計，即可開發出各種不同的基因敲除方法，如表 1所示。根據同源重組載體的不同，可以把基因敲除方法分為線性單鏈 DNA (ssDNA)、線性雙鏈 DNA (dsDNA) 以及環狀雙鏈DNA (質粒載體) 等3類。

表1 基于同源重組的基因敲除策略Table 1 Homologous recombination based gene knockout strategies

線性單鏈 DNA敲除策略不但打靶載體易于構建，且其重組效率是雙鏈DNA的10~100倍[9,11]。

采用線性雙鏈DNA進行同源重組，是近年來基因敲除方法的熱點之一。其優點是可以避免較為繁瑣的基因克隆和質粒載體構建步驟，而直接采用PCR方法擴增獲得目標同源重組片段。然而，線性雙鏈DNA易于被細胞內的RecBCD酶降解，為了解決上述問題，可以在線性雙鏈DNA的兩側引入Chi位點，保護 DNA不被 RecBCD消耗，并能強化RecBCD 介導的同源重組效率[10-11]。在應用越來越廣泛的Red/ET重組系統中，Gam (γ) 蛋白的引入同樣是為了抑制宿主菌的重組蛋白RecBCD的線性雙鏈DNA外切酶活性，從而協助Exo和Beta蛋白完成同源重組[14]。RecA輔助的λ Red重組則可進一步提高重組效率[15]。

構建環狀質粒載體進行目標基因敲除的方法，是實現微生物基因敲除的經典策略，主要通過微生物本身的 RecA重組系統 (主要包括 RecA和RecBCD等蛋白) 發揮作用。RecA蛋白是單鏈結合蛋白，促進各類DNA分子間的同源聯會、配對、鏈交換和分支遷移。RecBCD是由RecB、RecC和RecD三個蛋白組成的復合體，它能與雙鏈切口結合使DNA鏈解開，并在Chi位點形成單鏈，然后由RecA蛋白促進同源重組。由于RecBCD具有核酸外切酶V的活性，所以線性DNA分子在細菌體內會被降解。因此，必須通過環狀質粒載體克隆來完成同源重組片段的分子設計和構建。通常情況下，實現同源重組的同源臂長度都在數百bp或更長。插入型敲除可以通過同源單交換實現，而置換型敲除則需要通過同源雙交換來實現。在上述過程中，為了強化同源重組發生的效率，良好區分單交換和雙交換型重組菌株，并使發生交換后的質粒從宿主菌中快速去除，可以采用在質粒載體上相應設計兩個不同的正負篩選標記及構建自殺型或溫度敏感型質粒載體等策略[16-21]。

隨著基因敲除技術的發展，除了同源重組外，位點特異性重組和轉座重組引起的基因插入突變也逐漸受到重視。下面就細菌、放線菌等工業微生物中應用的 3種重要的基因敲除策略進行詳細的介紹和討論。

3 幾種高效的基因敲除策略

3.1 采用線性雙鏈DNA的Red/ET重組系統

Red重組系統原來是屬于λ噬菌體的重組系統，其編碼基因exo和bet置于PL操縱子的控制之下。exo基因的產物Exo蛋白 (也稱為Red α 蛋白) 是λ核酸外切酶，它可將 dsDNA的 5′端切開，產生 3′突出端。bet基因編碼的β蛋白，是具有退火和鏈侵入功能的單鏈結合蛋白。當發生同源重組時，帶有同源臂的供體 DNA分子首先經 Exo蛋白 (Red α)作用而使其兩端形成單鏈懸突；之后β蛋白形成環形結構并結合到3′突出末端，對ssDNA進行保護，并依靠被結合的同源臂進行配對重組。為起到這一作用，β蛋白只需要結合35 bp的單鏈核苷酸即可。與傳統的大腸桿菌同源重組系統相比，Red α蛋白的功能類似于RecBCD，而Red β蛋白的功能類似于 RecA[22]。因此，Red 重組系統可以不依賴于RecA蛋白而完成同源重組。但是，缺失RecA不僅使重組效率下降，而且載體穩定性也會有所下降[15]。

另外，Stewart等在 1998年還報道了一種通過在大腸桿菌中誘導表達Rac噬菌體的RecE和RecT蛋白來介導同源重組的ET重組系統[23]。其中RecE和Red α蛋白的作用相似，RecT和Red β蛋白的作用相似，所以經常和 Red重組一起被稱為 Red/ET重組系統。

Datsenko和 Wanner等以Red重組系統為核心開發了一套輔助質粒基因敲除程序，以其諸多優點和較為廣泛的普適性被大量運用到基因敲除的研究中[13,24]。他們運用這套基因敲除程序在大腸桿菌中完成了 40個以上不同染色體基因的敲除而未產生任何差錯。以β-xylosidase 基因yagH的敲除為例，應用λ Red質粒重組系統進行基因敲除的基本流程如圖2所示，其中，使用的輔助質粒共有3個，一個是帶有兩個 FRT片段及中間嵌入抗性片段的抗性片段模板質粒pKD13；一個是可以表達Red重組酶的同源重組輔助質粒 pKD46；另外一個是帶有FLP酶表達系統的抗性去除輔助質粒pCP20。其中，pKD46和 pCP20輔助質粒都是溫敏型復制子，在42℃下質粒復制被抑制并在傳代過程中丟失。

由圖2可見，使用輔助質粒的Red重組系統一般包括4個主要步驟。第1步，是以pKD13為模板的基因擴增，通過PCR引物設計，引入待敲除目標基因兩側的延伸同源序列 (約 50 bp)，獲得中間為Kan抗性基因和FRT標記、兩側為短同源臂的線性同源重組片段。第 2步是核心的同源重組，包括將攜帶Red重組酶的質粒pKD46轉入目標細胞、表達了Red重組酶的感受態細胞的制備、同源片段的電轉化導入及同源重組發生等幾個關鍵步驟。其中，感受態細胞的制備一定要在阿拉伯糖誘導質粒pKD46的ParaB啟動子高效表達γ、β和α蛋白之后；而質粒 pKD46的去除則采用 42℃熱激偶合氨芐青霉素抗性負篩選的策略。同源重組之后，Kan抗性基因即成功插入染色體，并替代原yagH基因。第3步是成功敲除目標基因的陽性重組子的菌落PCR篩選和驗證。最后一步，是在陽性重組子的細胞中轉入表達FLP重組酶的輔助質粒pCP20，FLP重組酶直接作用于抗性基因外延兩端的兩個對應 FRT區(FLP的識別目標) 并再次發生同源重組，用一個FRT片段代替原有的兩個FRT片段及中間的抗性基因，從而達到去除抗性基因的目的。質粒pCP20的去除則同樣采用42℃熱激偶合抗生素抗性負篩選的策略。

圖2 應用λ Red質粒重組系統進行yagH基因敲除的流程示意圖Fig. 2 Steps of yagH gene knockout using the plasmid- assistant λ Red recombination. Step 1: preparation of PCR recombination product using pKD13 as template and yagH1/yagH2 as primers. pKD13: Template plasmid. FRT: FLP recombinase recognition target. yagH1, yagH2: yagH extension primers around 50 bp. k1, k2: Kanamycin (Kan) test primers. Step 2: gene knock-out by homogeneous recombination via electroporation, transforming the purified PCR product from step 1 into competent cells of the target strain expressed the Red recombinase (Red α, β and γ proteins) by plasmid pKD46 (Amp). yagG: upstream gene of yagH in chromosome. yagI: downstream gene of yagH in chromosome. Step 3: colony PCR verification of the target recombinant with inserted Kan resistance. Primer-pairs of “Valid sense-k2” and “k1-Valid antisense” were used for target identification. Step 4: removal of the flanked Kan resistance cassette via helper plamsid pCP20 (Amp, Cm). Primer pairs of “Valid sense-k2” and “Valid sense-valid antisense” were used for target strain identification. The positive recombinant with removed Kan gene would show no band via primers “Valid sense-k2”, and 600 bp band via primers “Valid sense-valid antisense”.

這套質粒輔助λ Red重組酶基因敲除系統有如下優點：操作過程簡便，無須構建重組自殺質粒，直接通過線性片段轉化實現同源重組，避免了繁瑣的酶切及連接過程；可去除抗性篩選基因，用同一套抗性輔助質粒系統可進行多基因疊加敲除；只需很短的同源片段 (30~50 bp) 即可完成同源重組，節省了人力物力，尤其是在基因序列不很清楚的情況下，可根據有限的基因序列信息設計同源片段實施基因敲除；同源重組效率高，準確度高。目前，這套系統已經廣泛應用于大腸桿菌、痢疾桿菌、鏈霉菌等多種微生物的基因敲除中[25-26]。

3.2 使用環狀質粒載體介導的同源單交換和雙交換策略

使用環狀質粒載體進行基因敲除的首要條件是要選擇宿主細胞的自殺質粒載體來攜帶目標基因的同源序列。在實施目標基因敲除過程中，只發生一次同源重組的，稱為同源單交換。該方法簡單、易行，單交換發生后整個質粒載體插入到目標基因內部，同時產生兩個拷貝的無活性目標基因。其示意圖如圖3A所示。

在具體實施過程中，需要注意的是構建同源重組載體時，目標基因片段要選擇中間一段，即不含有起始密碼子ATG和終止密碼子TGA。一般情況下，單交換比較穩定，回復突變的概率僅為 10?4~ 10?5/代[20]。馬玉超等利用此法成功敲除了丙烯酰胺生產菌株紅色紅球菌的副產物基因[27]。

顧名思義，同源重組雙交換就是要通過兩次單交換才能達到敲除目標基因的目的，又分為缺失突變和插入突變兩種類型，如圖3B和圖3C所示。缺失突變是指基因敲除后使基因組上的目標基因缺失編碼區中的某一段而達到失活目標基因的目的；插入突變則是指基因敲除后使基因組上的目標基因內部插入額外一個基因而達到目標基因失活的目的。為了便于后期篩選雙交換重組子，額外插入的基因通常為抗生素抗性基因。

圖3 應用環狀質粒載體的同源單交換和雙交換策略Fig. 3 Homologous single crossover and double crossover strategies using circular plasmid vector. (A) Gene knockout by homologous single crossover. (B) Gene knockout by homologous double crossover with lost internal sequence of target gene. (C) Gene knockout by homologous double crossover with inserted SAG marker. AG: antibiotic gene. SAG: second antibiotic gene.

同源雙交換的難點之一是如何提高第二次同源重組的效率。針對該問題，可以采用合適的負篩選標記，使含載體序列的細胞對某些特殊的培養條件敏感，從而促進同源重組的發生和載體序列丟失，極大地提高篩選效率。SacB是Bacillus subtilis的果聚糖蔗糖酶[28]，可轉化蔗糖產生果糖并合成果聚糖，在革蘭氏陰性菌中，果聚糖在細胞周質空間大量積累，會堵塞周質空間而使細菌致死。當以SacB為負篩選標記時，在添加蔗糖條件下，只有發生同源重組雙交換的細胞才能夠存活。由于較為普遍的適用性和篩選方法的簡單性，許多革蘭氏陰性細菌均采用sacB基因作為負篩選標記。另外，也有此系統成功應用于革蘭氏陽性菌的報道[29]，此系統的優點是可以在不引入抗生素抗性的基礎上連續高效地敲除多個基因。

目前，除了大腸桿菌、酵母菌等一些模式菌株的遺傳轉化效率較高、方法簡便外，其他一些菌株的遺傳背景不是很清楚，需要用電轉化儀才能將質粒導入宿主細胞。所以，同源重組的另一個難點是如何用簡便的方法將質粒導入目標基因的宿主細胞。針對該難點，研究者可以將可移動原件mob引入載體，從而使載體能夠通過簡單的細菌接合實驗高效地導入細胞中。

3.3 采用轉座酶介導的轉座重組

基因轉座子 (Transposon，Tn) 是一種DNA序列單元。它能夠隨機插入到細菌染色體的許多位點上，使得插入位置的基因失活或突變[6-7]。轉座子能夠啟動不同類型的重組事件發生，還可從插入位點脫落下來。在脫落時，可攜帶宿主基因組的一部分DNA片段，造成基因缺失。利用該特性，轉座子被廣泛應用于基因敲除研究中，成為改良菌種的新技術。典型的轉座子其兩端多為兩個顛倒重復序列(IS序列)，在重復序列之間有編碼抗生素的基因及轉座酶。常見的轉座子有 Tn5、Tn10、Tn916等。其中，Tn916具備廣泛的寄主范圍，可以應用于多種革蘭氏陽性菌與革蘭氏陰性菌。轉座子插入后穩定性好，不容易發生回復突變。

采用基因轉座子對目標基因組進行隨機敲除，構建基因敲除突變庫，然后對目標突變庫進行高通量篩選，獲得所需要的表型，是近來反向代謝工程的研究熱點之一，其示意圖如圖4所示[30]。

圖4 采用基因轉座子進行基因組隨機敲除突變庫構建和目標表型篩選示意圖[30]Fig. 4 Construction of the transposon random gene knockout library and selection or screening of the target phenotype[30].

對于敲除基因的篩選與鑒定，Badarinarayana在2001年報道了一種應用轉座子和自殺質粒進行基因插入敲除的新方法[31]。Hal Alper等利用類似的方法，成功篩選并鑒定了在重組大腸桿菌中高產番茄紅素所必須敲除的 3個負調控基因；將這 3個基因與理論預測的 4個基因偶合起來進行不同組合突變，獲得了64株敲除不同基因的突變株。全局最優突變株的番茄紅素的產率較原始菌株提高了9倍[30]。

然而，由于轉座子自身編碼轉座酶，從而遺傳穩定性存在問題；轉座子片段過大，插入后對受體菌株帶來負擔，以及需要構建自殺質粒作為載體等問題，近年來進一步發展了EZ-Tn5TMInsertion Kits轉座敲除系統[32]。可以通過體外反應，使得Tn5轉座酶與線性DNA形成聯合復合體，繼而電轉化進入宿主細胞，進行高效的基因隨機插入敲除。線性DNA聯合復合體的中間部分是抗生素抗性基因，兩端各含有19 bp的反向重復序列 (ME)，是Tn5轉座酶的結合位點。研究表明，上述轉座體系在多種革蘭氏陰性或陽性細菌中均適用。

采用TAIL-PCR (Thermal asymmetric interlaced PCR) 方法[33]或EZ-Tn5? Insertion Kits中專門設計的測序定位引物，還可特異性地擴增轉座子IS序列的側翼被敲除基因，從而鑒別或發現與目標表型特征相關的功能基因，并構建或重構基因敲除前后各表型相關的代謝途徑。根據這些新的基因型和代謝途徑信息，反過來又可進一步提出理性設計策略，構建性能更加優越的重組菌株。

轉座子基因敲除系統的缺陷是，基因插入過程基本上是隨機的，一般不能用于某一特定基因的敲除，也很難在基因組范圍內突變所有的基因。因此，通常將轉座子突變系統與直接突變的方法進行互補。

4 基因敲除技術的發展及展望

綜上所述，根據重組位點特征的不同，基因敲除技術可以分為依賴于較長同源序列的同源重組、依賴于短同源序列的位點特異性重組以及不依賴于同源序列的轉座敲除等 3種主要類型。其中，位點特異性重組主要在酵母菌等真核生物中應用。

隨著遺傳學和分子生物學理論的發展，新的基因敲除原理也在不斷的發掘和發現。最具代表性的就是RNA干擾 (RNA interference，RNAi) 技術[34]。RNAi是指通過利用短片段的雙鏈RNA促使特定基因的mRNA降解來高效、特異地阻斷特定基因的表達，誘使細胞表現出特定基因沉默的表型。由于少量的雙鏈RNA就能阻斷基因的表達，并且這種效應可以傳遞到子代細胞中，所以 RNAi的反應過程也可以用于基因敲除。到目前為止，RNAi技術作為基因沉默的工具，被研究人員廣泛應用到真核生物細胞的功能基因組學、藥物靶點篩選、細胞信號傳導通路分析、疾病治療等研究領域[34]。與傳統的基因敲除技術相比，RNAi技術具有投入少、周期短、操作簡單等優勢，具有良好的發展前景。

總結了細菌、放線菌、酵母菌和霉菌等幾種重要工業微生物中已經成功應用的基因敲除策略，見表2。

表2 幾種重要工業微生物中成功應用的基因敲除策略Table 2 Feasible gene knockout strategies applied in some important industrial microbes

然而，盡管基因敲除技術的原理在發展，應用越來越廣泛，但基因敲除技術始終存在著一個難以克服的缺點，即敲掉一個基因并不一定就能獲知該基因的功能，也不一定能夠顯著改變細胞的代謝途徑，從而獲得預期的表型。這是由于，一方面，許多基因在功能上經常是冗余的，敲掉一個在功能上冗余的基因，并不能造成容易識別的表型，因為基因家族的其他成員也可以提供同樣的功能；另一方面，對于某些必需基因，敲除后又會造成細胞的致死性，也就無法對這些必需基因進行相應的研究了。此外，對于一個目標產物合成的代謝途徑，產物 (或副產物) 的增多 (或減少) 通常需要眾多基因的協同作用，只針對單個基因的敲除研究有時不容易獲得很好的結果。

針對這一現象，Hal Alper等提出了全局轉錄機器工程 (Global transcriptional machinery engineering，gTME) 的新思路[49-51]。以基因轉錄機器——RNA聚合酶 (RNA polymerase，RNAP) 為對象，可以同時實現眾多不同基因的轉錄抑制、轉錄強化以及轉錄不變，進而在細胞水平上實現目標表型的全局優化。

2009年，Wang等進一步報道了運用多元自動基因組工程 (Multiplex automated genome engineering，MAGE) 加速進化重組細胞的新方法[52]。他們通過λ-Red β蛋白輔助重組，在單鏈寡核苷酸中大規模引入番茄紅素合成途徑的 24個目標基因的插入和敲除突變，建立了多元復合基因突變庫，實現多個目標位點的同時定位、突變。進而通過自動化裝置的設計和構建，實現了細胞代謝途徑的連續、自動控制改造。在3 d之內，Wang等就篩選得到了番茄紅素產量提高5倍的重組突變株。

綜上所述，微生物基因敲除技術是遺傳工程研究的重大飛躍之一。它為定向改造細菌、放線菌、酵母菌、霉菌等工業微生物、培育微生物新品種提供了重要的技術支持。隨著后基因組時代的到來以及各種生物學實驗方法的日益進步，基因敲除技術作為一種強而有力的工具，必將繼續在生物能源、生物材料、生物法化學品以及環境保護等重要領域作出重大貢獻。

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Gene knockout strategies for metabolic pathway regulation in industrial microbes

Huimin Yu1, and Yuchao Ma2

1 Department of Chemical Engineering, Tsinghua University, Beijing 100084, China
2 College of Biological Sciences and Biotechnology, Beijing Forestry University, Beijing 100083, China

Gene knockout, an important technology in molecular biology, has been broadly applied in industrial microbial metabolic engineering. From the basic mechanism of DNA recombination, we summarized and compared in this review different gene knockout strategies. Three most hot and important approaches, including the λ Red recombination system using the linear dsDNA as recombination substrate, the single or double crossover homologous recombination using the circular plasmid DNA as substrate, and the transposase mediated transposition recombination, were summarized in detail. Developing frontiers and application prospects of gene knockout were further discussed.

gene knockout, λ Red recombination system, single or double crossover, homologous recombination, transposition recombination

生命的代謝活動是通過活細胞和細胞群的代謝網絡進行的，后者由一系列酶催化反應以及特異性的膜轉移系統構成。然而，細胞自身固有的這種代謝網絡相對于實際應用而言，其遺傳特性通常并非最佳，這就需要對細胞的代謝途徑進行有目的的修飾與調控。1991年，Bailey和Stephanopoulos在Science上分別發表重要文章[1-2]，提出了“Metabolic Engineering”的概念，綜述了代謝工程的應用實例，指出了存在的問題及發展的方向，被認為是代謝工程向一門系統的學科發展的起點。

May 11, 2010; Accepted: August 2, 2010

Supported by: National High Technology Research and Development Program (863 Program) (No. 2007AA02Z201), National Basic Research Program (973 Program) (No. 2007CB714304), National Natural Science Foundation of China (No. 20976094).

Huimin Yu. Tel: +86-10-62795492; E-mail: yuhm@tsinghua.edu.cn

國家高技術研究發展計劃 (863計劃) (No. 2007AA02Z201)，國家重點基礎研究發展計劃 (973計劃) (No. 2007CB714304)，國家自然科學基金 (No. 20976094) 資助。