干擾素脂質體的制備與質量控制

曾德貴，曾洪輝

(1.廣東省深圳市慢性病防治中心，廣東 深圳 518020;2.廣東省藥物研究所，廣東 廣州 510440)

干擾素作為細胞因子常被用來治療多種疾病，但其血漿半衰期極短，且副作用大。干擾素為一種活性蛋白質，在體內易被各種蛋白酶降解或作為抗原被免疫系統排除，因此常規的全身或局部給藥方式難以使干擾素在病變部位達到較高濃度，藥物的利用度很低。應用脂質體包裹干擾素能顯著改善其體內的藥代動力學，提供靶向定位給藥，從而增加干擾素的應用范圍[1]，提高藥物穩定性，并大幅度降低干擾素的毒副作用。為此，筆者制備了干擾素脂質體，并對其處方、工藝制備、粒徑、包封率等進行研究，還建立了質控體系，報道如下。

1 儀器與試藥

細胞培養設備;722型分光光度計(上海第三分析儀器廠);SB3200型旋轉蒸發器(上海醫械專機廠);超速離心機(美國Beckman);CK2型倒置光學顯微鏡(日本Olympus);H600-4型電子顯微鏡(日本Nikon);AS3120型超聲波儀(天津奧特賽恩斯儀器公司)。色譜用CM-葡聚糖凝膠、乙二醇單甲醚(試劑級);凍干精制人白細胞干擾素(100萬U/支，哈藥集團生物工程有限公司);BR生物試劑脫氧膽酸鈉(北京市海淀區微生物培養基制品廠);卵磷脂、膽固醇(Sigma產品);IMDM培養基(Gibco產品);胰酶(Difco產品);L929細胞(天津醫學院提供);濾泡性口炎病毒(VSV軍事醫學科學院干擾素組提供)。

2 方法與結果

2.1 處方與制備

處方:卵磷脂40 mg，膽固醇20 mg，氯仿4 mL，乙醚4 mL，磷酸鹽緩沖液(pH=7.4)0.5 mL，干擾素-α 100萬U。

制備:取卵磷脂40 mg、膽固醇20 mg，溶于氯仿4 mL，于40℃水浴中，以100～150 r/min轉速蒸發后，加入乙醚4 mL，并將干擾素-α 100萬U溶于0.5 mL磷酸鹽緩沖液(pH=7.4)中并與之混合，二者經超聲處理后進行乳化，然后于40℃水浴中以100～150 r/min轉速減壓，除去有機溶劑即可形成α-干擾素脂質體，最后再通過凝膠柱層析方法除去未包入的藥物，得到不含游離的α-干擾素脂質體。

2.2 質量控制

2.2.1 外觀形態

在干擾素脂質體制備的過程中，利用光學顯微鏡對粗制脂質體進行觀察，脂質體呈圓形顆粒狀，大小比較均勻。制備的脂質體成品經負染色后進行電鏡觀察，其背景為黑色，干擾素脂質體為白色圓球顆粒，表面光滑、規整，分散性良好。

2.2.2 粒徑測定

取當日新制備的脂質體干擾素-α，加適量生理鹽水稀釋，滴在載膜銅網上，4 min后用濾紙吸去多余的水分，然后滴入2%磷鎢酸(pH=7.4)，4～5 min后吸去多余的磷鎢酸溶液，晾干，于電子顯微鏡下觀察規則圓點，用庫爾特粒子分析儀測定粒子大小和分布，經檢測，干擾素脂質體粒徑為正態分布，脂質體平均粒徑為285.6 nm。

2.2.3 包封率測定

微形柱制備:取5 mL注射器筒1個，底部置入一略小于內徑的圓形尼龍網，然后加入適量(5 mL)經pH為7.2的磷酸鹽緩沖液浸泡的葡聚糖凝膠G-50，將裝好的注射器筒放入干燥離心管內，于4℃ 1 500 r/min轉速離心5 min，備用。

游離人干擾素-α分離試驗:取含100萬U游離干擾素-α的液體，加到微型柱頂部，以1 500 r/min轉速離心5 min，收集濾液過濾除菌，作為A液備用。

干擾素脂質體中游離干擾素-α分離試驗:取相當于100萬U干擾素的脂質體干擾素-α，緩緩加入微形柱頂部，收集濾液，加適量0.4%脫氧膽酸鈉，溫度4℃，3 000 r/min轉速離心30 min，取下層液體，過濾除菌，作為B液備用。

測定方法:將A液和B液均配制成1 mL的溶液，并取干擾素-α 100萬U溶于1 mL緩沖液中，對此3種溶液采用“細胞病變抑制法”，攻擊病毒采用濾泡性口炎病毒，劑量為300 TCID50。采用40孔培養板。倍比稀釋待測上清液，每孔加入50 μL，隨后各孔加入L929細胞懸液50 μL(內含4×104個L929細胞)。設細胞對照和病毒對照，3個復孔。37℃ CO2孵箱中15 min。染畢，用水洗脫殘余染料。每孔加入200 μL，用震蕩器振蕩，使染料完全從細胞內脫出。用可測微板的722型分光光度計于540 nm波長處比色。

計算包封率(EE):測得游離干擾素-α效價為997.86 U/mL(n=3)，干擾素-α脂質體經柱分離的游離干擾素-α效價為0，表明該柱能將干擾素完全吸附。將過柱后脂質體干擾素-α處理，測定效價為 633.84 U/mL(n=3)。EE(%)=(C游離-C未被包封)/C游離×100%=633.84/997.86×100%=63.52%。

2.2.4 有機殘留量檢測

按2005年版《中國藥典(二部)》要求，利用氣相色譜法測試干擾素脂質體溶液中的二氯甲烷(CH2Cl2)殘留量。按外標法計算含量，其結果遠低于藥典規定的0.06%。

2.2.5 微生物檢查

對干擾素-α脂質體及A液、B液進行鈷源照射滅菌，劑量為0.39 kGy，照射40 min后，接種血平板經24 h，無細菌生長，延至48 h，均無細菌生長。

2.2.6 樣品穩定性考察

將制備好的3批樣品分別放置在37℃，25℃，2～8℃不同溫度下，分別對其粒徑、滲漏率進行測定，不同時刻滲漏率的值為即時包封率與初始時刻包封率的差值。可以觀察到，溫度越高，脂質體越易滲漏。放置于4℃的3批脂質體，6個月后取樣觀察，無分層、沉淀及顏色變化，其粒徑、包封率和總體活性基本不變。

3 討論

逆相蒸發法[2]為制備大單層脂質體或數層脂質體較新的方法，特點是可包裹較大的水容積，適合于包裹水溶性藥物、大分子生物活性物質，如胰島素、干擾素等。試驗表明，制備中水浴溫度及旋轉速度是整個制備方法的關鍵，并可能影響相關各項試驗的結果。同時，適當調節磷脂質、有機溶劑、含藥緩沖液三者的比例，可獲得較高的包封率。包封率是脂質體的一個重要質量控制指標，脂質體包封率的測定方法選用細胞病變抑制法[3]，既可測定包封率，也可測定其生物活性。因為是通過測定包裹的干擾素生物活性來確定包封率大小，故需要選擇適當的裂解劑將脂質體裂解，并使干擾素充分釋放出來。在裂解劑作用下，裂解劑和磷脂膜的相互作用，使得磷脂雙分子層被破壞，磷脂分子分散到溶液中，作用時間越長，裂解越充分。另外，隨著裂解劑的濃度增大，脂質體顆粒裂解越來越充分，對干擾素活性的破壞也就有相應增大的趨勢，故裂解劑濃度增大至2.0%后，測定的干擾素脂質體活性不再繼續增加，甚至有下降趨勢。因此，選擇合適的裂解劑是客觀反映包封率和滲漏率的關鍵。

溫度對脂質體的包裹和裂解也有著重要的影響，在2～8℃條件下，脂質體滲漏率越小，穩定性越好。因為溫度越低，磷脂分子在膜中的流動性越小，膜的穩定性就越高，脂質體顆粒間的融合以及破裂程度就越小，脂質體顆粒之間相對穩定性的增強，減小了脂質體粒徑增大以及跨度變大的趨勢，從而降低了脂質體的滲漏率。另外，有機物殘留量的多少，同樣可以反映出脂質體制備工藝的好壞。因為干擾素是水溶性的大分子藥物，在制備的過程中受有機溶劑的影響而活性降低，所以應盡量控制不必要的有機物殘留，以提高脂質體產品的質量和穩定性。

本試驗所建立的干擾素脂質體的制備與質控體系能夠較好地反映出所制備的樣品質量。該方法操作比較簡便、易行，可信度高，適用于干擾素脂質體的大生產。

[1]胡大強，陳 雅.干擾素脂質體的研究進展[J].中國藥業，2001，10(9):58-59.

[2]陸 彬.藥物新劑型與新技術[M].北京:人民衛生出版社，2005:130.

[3]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(三部)[M].北京:化學工業出版社，2005:附錄56.