牛AMPK家族基因的研究進展

石秀英,房興堂,張春雷,陳 宏＊,2

(1.徐州師范大學生命科學學院,細胞與分子生物學研究所,江蘇徐州221116;2.西北農林科技大學動物科技學院,陜西省農業分子生物學重點實驗室,陜西楊凌712100)

1973年,Berg和Carlson等報道了一個與羥甲基戊二酸單酰CoA還原酶相關的蛋白激酶,隨后的研究表明,其活性受AMP(一磷酸腺苷)的調節,故稱為AMP激活的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)[1]。AMPK在真核細胞生物中廣泛存在,能感知細胞能量代謝狀態的改變,并通過影響細胞物質代謝的多個環節維持細胞能量供求平衡。近年來研究發現,AMPK在下丘腦攝食調控中起作用,激活 AMPK促進攝食,抑制 AMPK引起厭食[2,3]。

1 AMPK的結構

1.1 AMPK的結構及分布

AMPK作為能量調節器的最重要特征是它對細胞內能量狀態的高敏感性,而這種性質是由它獨特的生化結構決定的。1998年 Hardie等總結了AMPK的分子結構[4]。AMPK是一個異源三聚體蛋白,由催化亞單位α和調節亞單位β、γ構成,每個亞單位都是AMPK的活性所必需的。α和β亞單位各由兩個基因編碼(α1,α2和β1,β2),而γ亞單位則由三個基因編碼(γ1,γ2和γ3)。α亞單位的N末端是起催化作用的核心部位,含有一個典型的絲/蘇氨酸蛋白激酶的催化區域,C末端則主要負責活性的調節以及聯系β和γ亞單位[5]。α1由548個氨基酸組成,其中Thr172是一磷酸腺苷激活蛋白激酶的激酶(AMPKK)磷酸化位點,它是AMPK活性的關鍵;α2由554個氨基酸組成。α1在哺乳動物組織中分布較為廣泛,α2主要分布在骨骼肌、心臟和肝臟中[6]。β亞單位則好似一個支架,它可把α和γ亞單位連接起來[7]。β亞單位包含兩個保守區域,分別位于中心和C端,β亞單位C末端的保守結構域是形成三聚體的關鍵,是與α和γ亞單位結合的區域;而N末端含有N-異淀粉酶區域,稱作糖原結合域,其功能可能與糖原對AMPK的調節有關。β1具有廣泛的組織分布性,而β2主要分布在骨骼肌、心臟和胰腺中[8]。γ亞單位有4個串行重復的CBS(胱硫醚-β-合成酶 ,cystathionine-beta-synthase)區域,每個串聯重復序列由60個氨基酸構成,被命名為CBS模序,每一對CBS結構域可以形成一個有功能的Bateman域,可以結合一分子的AMP[9,10]。γ1和γ2分布較廣,而γ3只特異性地在骨骼肌中表達。

1.2 牛AMPK家族基因結構特征

McKay等對牛5′AMPK基因家族7個基因進行了研究,他們是 PRK AA1、PRK AA2、PRKAB1、PRK AB 2、PRK AG1、PRKAG2和PRKAG3,并初步將其分別定位于牛 20、3、17 、3、5 、4和2號染色體上[11]。牛PRKAB1共有7個外顯子,編碼的氨基酸全長為496個。Sazanov等用熒光原位雜交(FISH)分析將牛PRKAG1基因定位于5q21-q22上[12]。后來McKay等用全基因組輻射雜交圖譜證實了這一結論,Benkel等確定了牛PRKAG1基因的結構,其序列包括12個外顯子和11個內含子[13]。各物種的PRKAG3基因序列都包含13個外顯子和12個內含子[14]。Yu等運用韓國牛BAN文庫,確定了牛PRKAG3基因的結構和序列,PRKAG3基因包括13個外顯子,總長度約有 6.8 kb,編碼的氨基酸全長為465個,用Northern雜交分析證明牛與其他物種相似,且牛的PRKAG3基因也只在骨骼肌中表達[15]。Roux等分析了3個品種牛的PRKAG3基因序列及蛋白質序列,確定了牛PRKAG3基因包括13個編碼外顯子,和一個3'非編碼外顯子,在豬中影響肉質的突變位點在牛中突變頻率較低[16]。因而初步推斷牛PRKAG3基因也可能與肉質有關。

2 AMPK的功能

2.1 AMPK活性的調節

AMPK的活性主要受細胞中AMP/ATP比值的調節。此外,AMPK的活性也受酶的調節,目前已經發現AMPK的上游激酶有兩種:腫瘤抑制蛋白LKB和兩個附屬亞單位STRAD和MO25形成的復合體;鈣調蛋白依賴蛋白激酶激酶(CaMKK)。下游激酶已發現達數十種。人工合成的激動劑也能夠使AMPK活化,目前研究最為廣泛和深入的是5-氨基-4-甲酰氨咪唑核糖核苷酸(AICAR)。然而AICAR并非AMPK的特異性激動劑。AICAR是一種腺苷類似物,能夠被細胞攝取,在腺苷激酶的磷酸化作用下形成一磷酸衍生物5-氨基咪唑-4-氨甲酰核苷(ZMP),具有AMP樣作用,而ZMP也能夠影響其他AMP調節的酶(磷酸酯酶,果糖-1,6-二磷酸酶)的活性。盡管AMP/ATP比值升高是激活AMPK的經典途徑,但許多激素、細胞因子都參與了AMPK信號途徑,如瘦素、抵抗素、脂聯素、二甲雙胍和羅格列酮等也可激活AMPK。瘦素是由脂肪細胞分泌的激素,在調節脂肪酸氧化、葡萄糖攝取及阻止脂質在非脂肪組織聚積中起重要作用,有研究表明瘦素可能是通過AMPK對代謝起調節作用的。脂聯素是一種對抗糖尿病胰島素抵抗的激素,來自脂肪細胞,具有調節能量代謝、葡萄糖和脂肪代謝的作用。

2.2 AMPK對物質代謝的調節

在哺乳動物中,AMPK的活性與細胞能量水平密切相關。AMP/ATP比率的增加,能促使AMPK得到激活。AMPK被激活則ATP消耗的途徑將被關閉,而ATP生成的途徑將被開啟。近來的研究表明,AMPK可能在更大范圍內對全身的能量代謝起重要的調節作用。

2.2.1 AMPK對脂質代謝的作用 AMPK激活后不僅能增加脂肪酸氧化,而且還有抑制脂肪合成的作用。AMPK 活化使β-羥基-β-甲基-戊二酸單酰輔酶A還原酶(HMGR)和乙酰輔酶A羧化酶(ACC)、脂肪酸合成酶(FAS)以及甘油磷酸酰基轉移酶(GPAT)磷酸化失活,從而抑制膽固醇和脂肪酸的合成[17,18]。AMPK對脂質的另一調節途徑表現在對激素敏感脂酶(HSL)的作用上。

2.2.2 AMPK對糖代謝的作用 AMPK調節葡萄糖攝取可能通過兩種方式起作用:促進葡萄糖轉運體轉位和葡萄糖轉運子(GLUT)表達增加[19]。Halse在對離體骨骼肌細胞的研究中發現 AMPK不僅促使葡萄糖攝取,還抑制糖原的合成,從而促進葡萄糖向糖酵解方向轉化。大量研究結果表明,用不同方法活化AMPK可以增加肌細胞對葡萄糖的攝取,其機制可能是由于激活葡萄糖轉運體GLUT1和GLUT4所致。AMPK的激活引起糖酵解的限速酶-磷酸果糖-2-激酶(PFK2)磷酸化,刺激2,6-二磷酸果糖產生,從而促進糖酵解產生更多ATP。此外,AMPK的活化還能減少糖異生酶(如1,6-二磷酸果糖激酶、烯醇化酶)的表達,抑制糖異生,以及通過磷酸化糖原合成酶(GS)抑制糖原的合成[20]。

2.2.3 AMPK對蛋白質代謝的作用 AMPK對蛋白質合成代謝的抑制作用體現在對真核延長因子(eEF-2)激酶和哺乳動物的雷帕霉素靶體(mTOR)的作用上。eEF-2是蛋白質合成中肽鏈延伸所必需,可調節蛋白的轉錄,參與肽鏈的延長,其活性可被eEF-2激酶通過磷酸化而抑制。而AMPK可能通過激活eEF-2激酶,使eEF-2磷酸化失活,導致蛋白質合成受到抑制。mTOR作為胞漿內的激酶,是蛋白質翻譯中的重要調節物,生長因子可激活它,而營養撤除可抑制其介導的信號通路。有研究表明,AMPK和mTOR信號通路相關聯,活化的AMPK通過抑制mTOR及其效應器的活性,并增加eEF2的磷酸化,從而抑制蛋白質合成[21]。

2.2.4 對膽固醇合成的調節 3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶是膽固醇合成的關鍵酶。ATP減少時,AMPK激活使HMG-CoA還原酶的ser871位磷酸化而失活,因而膽固醇合成減少。有報道稱細胞與纖維粘連蛋白(Fn)分離后激活AMPK,HMG-CoA還原酶受抑制,使細胞膜膽固醇合成減少,Fn附著細胞則相反[22]。

2.2.5 AMPK與動物應激情況下動物代謝的關系AMPK在動物應激(生理、營養、環境和疾病等)過程中起著重要作用[23]。動物生產過程中,機體常遭受到來自外環境和生理因素的多種應激,而不管是外界應激還是自身應激因素,都會給機體造成重大的影響,輕者造成采食量下降,生產性能降低,重者導致死亡。雖然目前仍缺乏這方面的試驗證據,但可以推斷AMPK在該過程中發揮著重要的調節作用。應激條件下,AMPK被激活,抑制機體合成代謝,促進分解代謝,從而導致生長速率下降甚至失重。根據AMPK存在的廣泛性、進化的保守性和功能的專一性,不難假設,AMPK也與家畜應激的調節有關。高產奶牛的酮病,可能與應激使AMPK的活化有關。

3 牛AMPK家族基因的研究現狀

3.1 AMPK家族基因遺傳多態性的研究

Zhang等在4個牛品種PRKAB1基因7個外顯子及外顯子-內含子區發現29個單核苷酸多態性(SNPs):4個位于5'-UTR;8個位于編碼區,包括1個無義突變,1個錯義突變,6個同義突變;17個位于內含子區。此外在啟動子區發現了 12個SNPs和一個 10 bp的插入和一個 4 bp的缺失[24,25]。Benkel等在三個優秀的肉牛品種中,檢測了PRKAG1基因外顯子9到11的序列,在內含子10中發現4個SNPs[13]。Yu等在PRKAG3基因四個牛品種中發現7個SNPs。Roux等在3個牛品種中共發現了PRKAG3基因的32個SNPs,其中13個位于編碼區,1個位于3'非翻譯區,18個位于內含子中。5個導致了氨基酸的改變,且位于編碼區等位基因突變的頻率較低。在該基因的兩個位置上發現了可變剪切位點,導致了群體中出現異種蛋白[26]。McKay等利用混合測序法在牛PRKAG3外顯子2中發現2個突變其中1個同義突變和1個無義突變。

3.2 AMPK家族基因在其他方面的研究

Zhang等關于AMPK家族基因不同物種間密碼子使用頻率的研究顯示,基因的功能是決定密碼子使用偏好性的優勢因子,而物種差別只是很小的因素[27]。Benkel等的研究表明牛AMPKγ1蛋白編碼區其核苷酸序列與人和鼠的同源性分別為93%和90%,而牛AMPKγ1蛋白的氨基酸序列與人和鼠的一致性分別為98%和95%[11]。Roux等的研究結果表明牛AMPKγ3蛋白與人、豬和鼠的一致性分別為84%、83%和81%[26]。

4 AMPK家族基因的應用前景

AMPK廣泛存在于真核細胞中,哺乳動物的AMPK屬于高度保守的蛋白激酶家族,它是蛋白激酶級聯系統中的中心元件,在調節能量代謝的信號轉導機制中起著樞紐作用。AMPK在功能上的特點及進化上的保守性,說明該酶系在生物的遺傳與進化過程中起重要作用,有研究顯示在其他物種上的一些突變,可以改變AMPK的信號傳導和多個代謝途徑,也可推斷其在牛上亦有相同的作用,通過對其代謝的影響進一步影響其生長狀況;應激條件下,AMPK被激活,機體合成代謝受抑制,分解代謝加快,從而生長速率下降甚至失重;該基因在其他物種上與疾病的相關性,也可以認定為是牛抵抗疾病的候選基因;AMPK在下丘腦攝食調控中起作用,激活AMPK促進攝食,抑制AMPK引起厭食,從這一研究結果可以推測AMPK的突變也可能會對牛的體重產生影響。此外,人工激活劑AICAR可以通過激活AMPK進而對牛卵母細胞的核成熟有抑制作用[28],這一結果可以較好的為牛業同期發情處理提供理論資料。隨著對AMPK研究的日趨深入,人們對AMPK的功能已經有很多方面的了解。在牛上對該基因的研究及其對功能的驗證,可以促進其對生產的指導作用,進一步為動物的遺傳育種提供理論依據。當然,目前階段的研究尚不成熟,還需要進行進一步的研究,尤其是與生產性能相關的研究報道很少。

[1]Kemp B E,Mitchelhill K I,Stapleton D,et al.Dealing with energy demand:the AMP[J].activated protein kinase[J].Trends Biochem Sci.1999,24(1):22-5.

[2]Minokoshi Y,Alquier T,Furukawa N,et al.AMP-kinase regulates food intake by responding to hormonal and nutrient signals in the hypothalamus[J].Nature,2004,428(6982):569[J].574.

[3]Kim E K,Miller I,Aja S,et al.C75,a fatty acid synthase inhibitor,reduces food intake via hypotha-lamic AMP-activated protein kinase[J].Biol Chem,2004,279(19):19970-19976.

[4]Hardie D G,D Carling,M Carlson.The AMP-activated/SNF1 protein kinase subfamily:Metabolic sensors of the eukaryotic cell[J].Ann.Rev.Biochem,1998,67:821-855.

[5]Iseli T J,Walter M,van Denderen B J,et al.AMP-activated protein kinase beta subunit tethers alpha and gamma subunits via its C-terminal sequence(186-270)[J].J Biol Chem,2005,280(14):13395-134001.

[6]Turnley A M,Stapleton D,Mann RJ,et al.Cellular distribution and developmental expression of AMP-activated protein kinase isoforms in mouse central nervous system[J].J Neurochem.,1999,72(4):1707-1716.

[7]Cheung P C,Salt I P,Davies SP,et al.Characterization of AMPactivated protein kinase gamma-subunit isoforms and their role in AMPbinding[J].Biochem,2000,346(Pt 3):659-669.

[8]Thorton C,Snowden M A,Carling D.Identification of a novel AMP-activated protein kinase beta subunit isoform that is highly expressed in skeletal muscle[J].J Biol.Chem.,1998,273(20):12443-12450.

[9]Hardie D G.The AM P-activated protein kinase pathway-new players upstream and downstream[J].J Cell Sci,2004,117(Pt 23):5479-5487.

[10]Carling D.AMP-activated protein kinase:balancing the scales[J].Biochimie,2005,87(1):87-91.

[11]M cKay S D,White S N,Kata S R,et al.Thebovine 5'AMPK gene family:mapping and single nucleotide polymorphism detection[J].Mammalian Genome,2003,14(12),853-858.

[12]Sazanov A,Benkel B F,Hickey D A,et al.The bovine AMP-activated protein kinase subunit gamma 1 gene(PRKAG1)maps to 5q21-q22[J].Anim Genet,1999,30(6):473-474.

[13]Benkel B,Kollers S,Fries R,et al.Characterization of the bovine ampkgamma1 gene[J].Mamm Genome,2005,16(3):194-200.

[14]Park S H,Gammon S R,KniPPers JD,et al.Effect of Exereise Intensity on Skeletal Muscle AMPK Signaling in Humans[J].Diabetes,2003,52(9):2205-2212.

[15]Yu S L,Kim J E,Chung H J,et al.Molecular cloning and characterization of bovine PRKAG3 gene:structure,expression and single nucleotide polymorphism detection[J].Anim Breed Genet,2005,122(5):294-301.

[16]Roux M,Nizou A,Forestier L,et al.Characterization of the bovine PRKAG3 gene:Structure,Polymorphism,and alternative transcripts[J].Mammalian Genome,2006,17(1):83-92.

[17]Henin N,Vincent MF,Gruber HE,et al.Inhibition of fatty acid and cholesterol synthesis by stimulation of AMP-activated protein kinase[J].FASEB J,1995,9(7):541-546.

[18]Winder W W,Hardie DG.Inactivation of acetyl-CoA carboxylase and activation of AMP-activated protein kinasein muscle during exercise[J].J Am J Physiol,1996,270(2 Pt 1):E299-E304.

[19]Horie T,Ono K,Nagao K,et al.Oxidative stress induces GLUT4 translocation by activation of PB-K/Akt and dual AMPK kinase in cardiac myocytes[J].J Cell Physiol,2008,215(3):733-742.

[20]Luc Bert rand,Audrey Ginion,Christophe Beauloye,et al.AMPK activation restores the stimulation of glucose uptakein an in vit romodel of insulin resistant cardiomyocytes via the activation of protein kinase B[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol,2006,291(6):239-250.

[21]Horman S,Beauloye C,Vertommen D,et al.Myocardial ischemia and increased heart work modulate the phosphorylation state of eukaryotic elongation factor-2[J].J Biol Chem,2003,278(43):41970-41976.

[22]Han S,Khuri F R,Roman J.Fibronectin stimulates non-small cell lung carcinoma cell growth through activation of Akt/mammalian target of rap amycin/S6 kinase and inactivation of LKB1/AMP-activated protein kinase signal pathways[J].Cancer Res,2006,66(1):315-323.

[23]Park S H,Gammon SR,Knippers J D,et al.Phosphorylation-activity relationships of AMPK and acetyl-CoA carboxylasein muscle[J].JAppl.Physiol.,2002,92(6):2475-2482.

[24]Zhang Q,Chen H,Zhao S,et al.Single nucleotide polymorphisms and haplotypic diversity in the bovine PRKAB1 gene[J].M ol Biotechnol,2009,43(3):193-9.

[25]Zhang Q,Chen H,Zhao S,et al.Polymorphisms in the promoter region of bovine PRKAB1 gene[J].Mol Biol Rep,2009,(DOI 10.1007/s11033-009-9612-5).

[26]Roux M,Nizou A,Forestier L,et al.Characterization of the bovine PRKAG3 gene:structure,polymorphism,and alternative transcripts[J].Mamm Genome,2006,17(1):83-92.

[27]Zhang Q,Zhao S,Chen H,et al.Analysis of the codon use frequency of AMPK family genes from different species[J].Mol Biol Rep,2009,36(3):513-519.

[28]Bilodeau-Goeseels S,Sasseville M,Guillemette C,et al.Effects of adenosine monophosphate-activated kinase activators on bovine oocyte nuclear maturation in vitro[J].Mol Reprod Dev,2007,74(8):1021-1034.