核心蛋白多糖基因(DCN)的研究進展

孫加節,張春雷,房興堂,陳 宏＊,2

(1.徐州師范大學細胞與分子生物學研究所,江蘇 徐州 221116;2.西北農林科技大學動物科技學院/陜西省農業分子生物學重點實驗室,陜西 楊凌 712100)

核心蛋白聚糖(decorin,DCN)是一種富含亮氨酸的小分子蛋白多糖,由富含亮氨酸的核心蛋白和一條糖胺聚糖鏈組成,主要分布在人和動物的主動脈 、肺 、皮膚 、腎臟 、肌腱 、平滑肌 、骨 、軟骨 、臍帶 、韌帶、胎盤及角膜等部位的結締組織中,屬于細胞外基質(extracellular matrix,ECM)成分,與膠原纖維緊密相連,又叫 PG-2、PG-Ⅱ、PG-S2、PG-40 或 DS/CS-PGⅡ。由于電鏡下顯示其在膠原網絡中能夠修飾膠原纖維,故又稱為飾蛋白聚糖[1,2]。1978年,首次由美國國立衛生研究院骨科研究所的Fisher教授分離、純化[3]。1986年,Krusius等[4]通過提取人胚胎成纖維細胞系IMR290RNA、構建cDNA文庫,成功克隆DCN基因并測序鑒定。DCN的核心蛋白可以結合多種細胞因子或生長調節因子,包括轉化生長因子β(transforming growth factor,TFG-β)、纖連蛋白(fibronetin,FN)、血栓素結合蛋白(thrombospondin)及DCN胞吞受體等,并且具有多種生物活性,包括調節和控制組織形態發生、細胞分化、運動、增生以及參與膠原纖維的形成等過程。

1 Decorin的分子結構

核心蛋白聚糖(DCN)由一個球形的核心蛋白和一條含硫酸軟骨素(chondroitin sulfate,CS)/硫酸皮膚素(dermatar sulfate,DS)葡糖胺聚糖側鏈(glycosaminoglycans,GAG)組成[3]。DCN基因在人類基因組為雙拷貝,定位于12號染色體12q21-q22[5]。其核心蛋白相對分子質量為39 793,以富含10～12個亮氨酸重復序列結構域為主要特征,每個結構域長度約相當于24個氨基酸。人類DCN由359個氨基酸組成的(即包括3個終止密碼子 TAA在內共1 080 bp編碼),包含了N末端16個氨基酸的信號肽、14個氨基酸的前肽以及329個氨基酸組成的成熟核心蛋白[4],按其作用不同可分為4個功能域(functional domains)[6]。第一功能域包括最開始的N-末端的30個殘基,其中分別代表含有16個氨基酸的信號肽(signal peptide)和14個氨基酸的前肽(propeptide)。信號肽可引導新翻譯的核心蛋白進入粗面內質網加工結合GAG鏈并切除信號肽自身,而前肽含有許多酸性氨基酸,它可協助調節單鏈GAG與第二功能區N-端上的絲氨酸殘基結合。GAG側鏈連接成熟DCN氨基末端的一個絲氨酸殘基處,即為第二功能域的起始,葡糖胺聚糖鏈連接后與其他的GAG側鏈或者另外的核心蛋白發生相互作用,并為血栓素結合蛋白產生一個特異結合位點。GAG側鏈結合點緊隨的是一個富含半胱氨酸的區域,區域的中心是核心蛋白(core protein),則為第三功能域,其最大特點是在長度上包括24個氨基酸的富含亮氨酸的重復序列(leucine-rich repeat,LRRs),亮氨酸的殘基定位于 1、4、6、11 和14的LRRs片段中,LRRs基本特性是促進蛋白質之間的結合作用,可與 TGF-β發生結合反應,也是膠原特異性結合位點。第四功能域是位于C-末端的部分,結構特點是包含一個保守的34～41個殘基的二硫化物環,還包括膠原纖維和纖連蛋白細胞結合域的結合位點。

2 Decorin的生物合成

人類DCN基因的啟動子(promoter)被分為兩個確切的區域:約含188個堿基對的近側區和800個堿基對的遠側區[7]。近側區包括一個CAAT盒(上游啟動子元件)和位于轉錄起始點處的緊密排列的兩個TATA盒(真核生物啟動子元件),該區域也包括兩個腫瘤壞死因子α(TNF-α)反應成分,DCN基因表達的下調可以被 TNF-α誘導的核蛋白所介導,而后者則可以識別和結合近側區的TNF-α反應成分。第144～188之間的48個堿基對的區域是與主要轉錄起始點有關的部分,該區域包含激活蛋白-1(activator protein-1,AP-1)結合位點,AP-1結合位點處有 DCN基因表達的雙向調節因子[8]。DCN基因啟動子的遠側區包含大量的Cis反應成分(順式作用元件)及一個AP-1(轉錄因子)、一個AP-5(轉錄因子)、兩個NF-KB基序(反式作用因子)、TGF-β的負性調節成分等。其中TGF-β的負性調節成分已經在多種蛋白酶的序列中被發現,其功能可能是抑制DCN基因的轉錄。Borden等[9]觀察到用TGF-β處理過的腎小球膜細胞和鼠的肝細胞中的DCN基因的表達被上調。GAG側鏈的生物合成在粗面內質網中進行,第二功能域的絲氨酸被木糖轉移酶(xylosyltransferase)識別,木糖轉移酶又被兩個半乳糖殘基構成的三糖(trisaccharide)結合,糖醛酸(uronic acid)和半乳糖(galactosamine)共同建構核心結構,該結構可以在不同的水平上被修飾[10]。DCN的來源可以采取以下兩種方式:一是從組織中直接提取,二是可以利用DNA重組技術生產基因工程的產品,由于DCN廣泛分布于人和動物的各種組織當中,為此從組織中提取天然的DCN有廣泛的來源和技術上的可行性,如可以從動物的組織中分離及純化DCN[11]。目前國內王國華等[12]用二次色譜法分離提取出DCN,曹茂開等[13]用基因克隆技術成功獲得DCN。

3 Decorin的研究進展

3.1 Decorin與組織纖維化

組織纖維化是一個復雜的病理過程。它是指組織或器官纖維組織增生,膠原纖維明顯增加,包括細胞外基質(extracellular matrix,ECM)成分及量的改變。纖維化形成的關鍵是ECM的過度沉積,DCN的抗增殖活性能夠直接影響纖維化的形成。DCN是與膠原纖維相關的小分子間質性蛋白多糖,主要由皮膚成纖維細胞、肝星狀細胞及腎小球系膜細胞等產生,能調節和控制組織形態發生、細胞分化、運動、增殖及膠原纖維的形成等過程,對防止組織和器官的纖維化有重要作用。近年來對于纖維化的診斷和治療日益集中在分子和基因的水平,Isaka等[14]報道,給大鼠轉入DCN cDNA可治療腎小球腎炎所致的腎纖維化;Sayani等[15]在肥大性瘢痕中用DCN mRNA與TGF-β mRNA原位雜交研究顯示,DCN mRNA在組織受到損傷后12個月以內缺乏,而在12～36個月之間有較高的表達,正常組織中卻很少表達,可能提示DCN在纖維化的形成中起雙向調節作用。Scott等[16]研究發現,增生性瘢痕中DCN含量減少,只有正常組織的25%。DCN核心蛋白結構與Ⅰ型膠原結合,通過GAG側鏈之間形成的抗平行的雙螺旋結構使膠原分子的側向裝配受限,調節膠原纖維的直徑,并保證其正確裝配。增生期瘢痕(keloid)中的DCN mRNA表達明顯減少,膠原原纖維間的塑形分子結構消失,從而使膠原原纖維的形成和裝配失去限制。Neame等[17]在DCN與lumican調節膠原原纖維形成的研究中發現,DCN延遲纖維化初期的進程,并減小纖維的直徑,DCN與lumican協同作用比單獨作用顯示更大的延緩纖維化形成;研究顯示lumican并不競爭膠原纖維上DCN的結合位點,而且二者共同作用還增加纖維結構的穩定性。免疫電鏡示DCN可大量存在于膠原纖維的附近,通過調整膠原纖維的C-末端,在膠原形成的起始階段延遲原膠原纖維的組建,使膠原數量減少。Mietz等[18]應用酶聯免疫吸附沉淀(ELISA)法在體外培養Tenon′s囊纖維原細胞中加入100 g/L的DCN,發現能減少50%的Ⅰ型膠原纖維和80%的Ⅱ型膠原纖維的含量,并認為在整個實驗過程中對纖維原細胞的蛋白質無毒副作用。目前,一些國家已經嘗試將提取和人工合成的DCN通過適當的途徑用于動物和人體進行抗纖維化的治療,國內也有用DCN干預纖維化的成功實驗報道。相信以后DCN在這個領域的研究會更加成為熱點。

3.2 Decorin與腫瘤

近年研究發現DCN是多種細胞因子及生長因子的配體,參與細胞信息轉導和生長調控,特別是在腫瘤細胞的生長轉移過程中發揮重要作用,而成為腫瘤研究中的熱點。Santra等[19]給培養的結腸癌細胞轉染decorin cDNA,觀察到軟瓊脂培養基上形成的腫瘤體積明顯變小。并且,這種細胞生長抑制可以被decorin基因的反義寡核苷酸逆轉。Nash等[20]用兩種卵巢癌細胞株SKOV3和2 774體外培養,培養液中加入150～400 mg/mL濃度的Decorin,發現其對癌細胞生長有明顯抑制作用,并且這種抑制和卡鉑有協同效應。加入Decorin到肺鱗癌細胞株A431培養液,發現Decorin同樣可以使肺癌細胞生長停滯,并通過流式細胞方法檢測證明腫瘤細胞生長停滯在 G1期[21]。Koninger等[22]也發現Decorin可以通過細胞生長周期的G1-S關卡點,阻滯、延緩胰腺癌細胞增殖。膠質瘤細胞株分別進行Lewis大鼠顱內接種,結果發現表達decorin基因的CNS21細胞株接種的大鼠,體內瘤體生長減緩,其荷瘤生存期明顯延長,兩組比較有顯著性差異[23]。Stander等[24]用三種其他神經膠質瘤細胞株LN218、LN2229及 T98G轉染decorin基因后進行動物體內接種,發現轉染decorin基因后的腫瘤細胞株在體內形成的瘤體明顯減小,并且瘤體周圍有明顯的激活T細胞浸潤。還有比較早的研究用轉染decorin cDNA的結腸癌細胞接種小鼠,與非轉染癌細胞能成功接種相對,轉染decorin cDNA的結腸癌細胞不能在實驗動物體內形成瘤體[19]。另外,Grant等[25]通過研究發現,表達decorin基因的腫瘤細胞株接種裸鼠后,不但形成的腫瘤體積小,而且腫瘤血管再生能力也明顯減弱,瘤體內血管密度降低。Reed等[26]通過另一種方式證明了decorin基因的體內抗腫瘤作用。他們先給裸鼠接種A431肺鱗狀細胞癌細胞株,在接種5～12天,裸鼠出現接種的瘤體后,多次瘤體內注射decorin基因的腺病毒載體。結果移植瘤體生長減緩,瘤體與正常組織分界變清楚,并且在鱗狀細胞癌的移植瘤體內出現了數個角化珠。也就是decorin基因在抑制腫瘤細胞生長的同時,還有促進細胞分化的作用。Tralhao等[27]的研究更加令人振奮,他們的結果提示decorin基因的抗腫瘤作用不限于給藥腫瘤的局部,以及decorin基因的細胞生長調節作用具有選擇性。隨著對decorin基因及Decorin與腫瘤關系研究的深入以及對其作用機制的全面認識,它或許會在惡性腫瘤治療中發揮重要作用。

3.3 Decorin與肌肉生長發育

Decorin是肌肉細胞外基質的重要組分。在骨骼肌分化中,他們能夠結合幾種細胞外基質和胞漿膜蛋白,調節肌肉的形成[28]。在早期的四肢肌肉形成過程中,觀測到肌肉形成的起始與decorin表達具有時空相關性[29]。為了評價decorin在活體分化中的功能,將野生型和decorin缺失的成纖維細胞移植到雞的肢芽上。Decorin的缺乏增加了生肌細胞的遷移,并在四肢上有更廣泛的分布,這和骨骼肌分化的抑制相關,所有的表型在decorin重新表達后得到恢復[30]。MSTN,TGF-β超家族的成員,是一個胚胎期和生后的骨骼肌生長的負調節因子。它的功能是在發育的過程中維持適當的肌肉含量,并分布在成體中的骨骼肌、心臟、和脂肪組織中。無MSTN基因的純合老鼠骨骼肌含量是野生老鼠的二到三倍[31]。近來,表面細胞質基因組共振表明DCN與MSTN之間存在互相作用[32],一種鋅離子依賴的相互作用,并通過DCN核心蛋白調節。有趣的是,在試管中,固定化的DCN能夠恢復MSTN對成肌細胞的增殖抑制效果,表明DCN可能束縛MSTN到細胞外基質,并調節其在成肌細胞中的活性。這種影響可能在鼠骨骼肌發育中起關鍵作用,因為DCN和MSTN的mRNA表達方式是相似的,并在胚胎中明顯高于新生和成年的含量[33]。

3.4 Decorin在牛上的研究進展

目前,國內外對DCN基因的研究主要集中在人與鼠上,而關于牛的相關研究還比較少。牛DCN基因結構比較保守,一般由8外顯子、7個內含子及其他相關DNA元件組成(GenBank登錄號:NC 007303)。該基因全長約39 kb,其mRNA全長2 160 bp,編碼360個氨基酸(GenBank登錄號:NM 173906)。在以基因印記的方法來探索動物的生長發育過程中,Hasan Khatib[34]以牛的肝、腎、腦、肺、心臟、腦下垂體、肌肉、骨、胰腺、卵巢、羊膜、尿囊和絨毛膜等組織作為其研究對象,設計PCR引物擴增牛各組織DCN基因1041 bp的cDNA。測序結果與GenBank上公布的序列NM 173906比較,結果顯示序列在 nt315和 nt648發生 A>G突變,在nt789發生C>T突變,且牛的DCN基因不具有印記特征。在探索胎牛肌肉組織形態發生過程中,Nishimura與他的同事[35]研究了DCN基因的表達和空間分布。免疫印跡分析表明,核心蛋白聚糖已經存在于2.5個月的胎牛骨骼肌組織中,且早期胚胎階段糖胺聚糖鏈較晚期胚胎階段長,但核心蛋白大小相同。在胎牛發育一個月后,mRNA開始表達,但其水平相對較低。免疫熒光顯微鏡檢測結果顯示,在胎牛骨骼肌發育過程中,核心蛋白聚糖存在于組成膠原纖維的肌束膜中,而不是骨骼肌肌內膜。現在,雖然對于牛 DCN基因研究較少,但隨著對DCN基因研究的深度和廣度的增加,尤其是DCN基因的功能、表達、調節以及相關性研究,將得到發展和完善。

4 Decorin在肉牛育種中的應用展望

DCN基因可作為用來尋找與抗病及生產性能相關的侯選基因。目前,功能基因的克隆測序、定位和基因多態性與生產性能的相關性分析以及分子系統進化的研究己成為動物遺傳育種的熱點之一。盡管國內外學者對DCN基因研究較多,特別是近年來對其在抗纖維和抗腫瘤方面的研究,但是真正對DCN基因多態性及其與生產性能的相關性研究還比較膚淺,還不能在牛的育種和生產實踐中應用。在今后的研究中,應根據DCN基因的多態性來判斷其基因型,并對這些不同基因型進行分析,找出各種基因型與數量性狀的相關性,從而將分子生物學技術應用到動物育種實踐中去。

[1] Iozz R V.Matrix proteoglycans:from molecular design to cellular function[J].Annu Rev Biochem,1998,67:509-652.

[2] Yamaguchi Y,Mann D M,Ruoslahti E.Negative regulation of transforming growth factor-beta by the proteoglycan decorin[J].Nature,1990,346(19):281-284.

[3] Fisher L W,Term ine J D,Young M F.Deduced protein sequence of bone small proteoglycanⅠ(biglycan)shows homology with proteoglycanⅡ(decorin)and several nonconnective tissue proteins in a variety of species[J].J Biol Chem,1989,264(8):4571.

[4] Krusius T,Ruoslahti E.Primary structure of an extracellular matrix proteoglycan core priein deduced from clone cDNA[J].Proc Natl Acad Sci USA,1986,83(20):7683-7687.

[5] Davies M,Kastner S,Thomas G J.Proteoglycans:their possible role in renal fibrosis[J].Kidney Int Suppl,1996,54:S55-60.

[6] Diamond J R,Levinson M,Kresberg R,et al.Increased expression of decorin experimental hydronephrosis[J].Kidey Int,1997,51(4):1133-1139.

[7] Santra M,Danielson K G,Iozzo R V.Structural and functional characterization of the human decorin gene promoter[J].J Biol Chem,1994,269(1):579-587.

[8] Wegrowski Y,Paltot V,Gillery P,et al.Stimulation of sulphated glycosamonoglycan and decorin production in adult dermal fibroblasts by recombinant human interleukin-4[J].J Biol Chem,1995,307(3):673-678.

[9] Border W A,Noble N A,Yamamoto T,et al.Natural inhibitor of transforming growth factor-beta protects against scarring in experimental kidney disease[J].Nature,1992,360(6402):361-364.

[10] M oses J,Oldberg A,Eklund E,et al.Biosynthesis of the proteoglycan decorin.Identification of intermediates in galactosaminogly canassembly[J].J Biol Chem,1997,248(3):767-774.

[11] Andrade W,Branclan E.Isolation and characterization of rat skeletal muscle pG decorin and comparison with the human fibroblast decorin[J].J Biol Chem,1991,100(3):565-570.

[12] 王國華,柴玉波,何 鵬,等.核心蛋白聚糖的分離、純化及活性鑒定[J].中國生化藥物雜志,1999,20(6):321-323.

[13] 曹茂開,趙文明,侯云德,等.飾膠蛋白基因的 cDNA克隆與表達[J].西安醫科大學學報,2000,21(6):512-514.

[14] Isaka Y,Brees D K,Ikegaya K,et al.Gene therapy by skeletal muscle expression of decorinprevents fibrotic disease in rat kidney[J].Nature,1996,2(4):418-423.

[15] Sayani K,Arim N.In situ hybridization for decorin and transforming growth factor-beta in hypertrophic scar[J].Masters Abstr Int,1997,36(1):502-505.

[16] Scott P G,Ghahary A,Tredget E E.Molecular and cellular aspects of fibrosis following thermal injury[J].Hand Clin,2000,16(2):271-287.

[17] Neame P J,Kay C J,McQuillan D J,et al.Independent modulation ofcollagen fibrillogenesisby decorin and lumican[J].Cell M ol Life Sci,2000,57(5):859-863.

[18] Mietz H,Chevez B P,Lieberman M W,et al.Decorin and suramin inhibit ocular fibroblast collagen production[J].Graefe′s Arch Clin Exp Ophthalmol,1997,235(6):399-403.

[19] Santra M,Skorski T,Calabretta B,et al.De novo decorin gene expression suppresses t he malignant phenotype in human colon cancer cells[J].Proc Natl Acad Sci USA,1995,92(15):7016-7020.

[20] Nash M A,Loercher A E,Freedman R S.In vitro growth inhibition of ovarian cancer cells by decorin:synergism of action between decorin and carboplatin[J].Cancer Res,1999,59(24):6192-6196.

[21] Iozzo R V,Moscatello D K,McQuillan D J,et al.Decorin is abiologicalligand forthe epidermal growth factor receptor[J].J Biol Chem,1999,274(8):4489-4492.

[22] Koninger J,Giese N A,M ola F F,et al.Overexpressed decorin in pancreatic cancer:potential tumor growt h inhibition and attenuation of chemot herapeutic action[J].Clin Cancer Res,2004,10(14):4776-4783.

[23] Biglari A,Bataille D,Naumann U,et al.Effect s of ectopic decorin in modulating intracranial glioma progression in vivo in a rat syngeneic model[J].Cancer Gene Ther,2004,11(11):721-732.

[24] Stander M,Naumann U,Dumitrescu L,et al.Decorin gene transfer-mediated suppression of TGF-beta synt hesis abrogates experimental malignant glioma growth in vivo[J].Gene Ther,1998,5(9):1187-1194.

[25] Grant D S,Yenisey C,Rose R W,et al.Decorin suppresses tumor cell-mediated angiogenesis[J].Oncogene,2002,21(31):4765-4777.

[26] Reed C C,Gauldie J,Iozzo R V.Suppression of tumorigenicity by adenovirus mediated gene t ransfer of decorin[J].Oncogene,2002,21(23):3688-3695.

[27] Tralhao J G,Schaefer L,Micegova M,et al.In vivo selective and distant killing of cancer cells using adenovirus2mediated decorin gene transfer[J].FASEB J,2003,17(3):464-466.

[28] Casar J C,McKechnie B A,Fallon J R,et al.Transient up regulation of biglycan during skeletal muscle regeneration:delayed fiber growth along with decorinincrease in biglycan-deficient mice[J].Dev.Biol,2004,268:358-371.

[29] Hugo C,Olguin,C S,Enrique B.Inhibition of myoblast migration via decorin expression is critical for normal skeletal muscle differentiation[J].Developmental Biology,2003,259:209-224.

[30] Velleman S G,Liu X,Eggen K H,et al.Developmentalregulation ofproteoglycan synthesis and decorin expression during turkey embryonic skeletal muscle formation[J].Poult Sci,1999,78:1619-1626.

[31] Lin J,Arnold H B,Della-Fera M A,et al.Myostatin knockout in mice increases myogenesis and decreases adipogenesis[J].Biochem Biophys Res Commun.2002,291:701-706.

[32] Miura T,Kishioka Y,Wakamatsu J,et al.Decorin binds myostatin and modulates its activity to muscle cells[J].Biochem Biophys Res Commun.2006,340:675-680.

[33] Nishimura T,Ojima K,Hattori A,et al.Developmental expression of extracellular matrix components in intramuscular connective tissue of bovine semitendinosus muscle[J].Histochem Cell Biol,1997,107:215-221.

[34] Hasan K.The COPG2,DCN,and SDHD genes are biallelically expressed in cattle[J].Mammalian genome,2005,16:545-552.

[35] Nishimura T,Futami E,Taneichi A,et al.Decorin expression during development ofbovine skeletal muscle and its role in morphogenesis of the intramuscular connective tissue[J].Cells Tissues Organs,2002,171:199-214.