西紅花苷對氧化性低密度脂蛋白致內皮細胞損傷的保護作用

裴鳳群

(平煤醫療集團職業病醫院 河南 平頂山 467000)

1 實驗材料

1.1 實驗藥物

濃縮到每mL相當于3.338g生藥西紅花水提物。獲取過程:新疆西紅花200g,水2500mL,加熱到沸騰,然后提取1.0h,然后對混合液過濾,最后把濾液濃縮提純到實驗所需濃度。

1.2 實驗動物

大鼠乳鼠:出生5～7d的Wistar。

1.3 實驗試劑

氧化低密度脂蛋白,乙酸乙酯,α-苯基-N-叔丁基氮氧化物。

1.4 實驗儀器

超凈工作臺,MCO-15AC型CO2培養箱,H2S-H型恒溫水浴振蕩器,LDZ4-0.8型離心機,MK型倒置顯微鏡,QL-901旋渦混合器,ESR200D-SRC型電子自旋共振波譜儀。

2 實驗方法及過程

2.1 培養大鼠原代心肌微血管內皮細胞(rCMEC)

首先進行大鼠的原代培養rCMEC,然后再進行傳代培養,傳代培養前需先進行rCMEC鑒定,培養出的第三代細胞用于實驗[1]。

2.2 實驗方法

(1)配制自旋捕獲劑PBN:取溫浴無菌PBS,把準確稱取的PBN放入其中進行溶解,然后把其置于磁力攪拌器上進行攪拌,攪拌時間30min左右,成為200mmol.L-1,PH=7.4的PBN飽和溶液,實驗時候把飽和溶液加入到等量的培養基中,最后得到濃度為100mmol.L-1的PBN溶液,作為電子自旋捕獲劑。(2)自由基的捕集及內皮細胞培養:把內皮細胞以每孔0.8mL接種于24孔板,密度為1.5×105個/mL,24h細胞貼壁后,把其分為空白對照組、模型對照組、西紅花水提物組等6組。各組共同孵育24h。然后,各組均換成100μg.mL-1的ox-LDL的無血清培養基0.25mL,同時將終濃度為100mmol.L-1的PBN0.25mL加入各組,并小心吹打均勻。于37℃時,孵育45min,然后把培養板取出來,用細胞刀,小心刮取細胞,將收集到的細胞懸液置于于5mLEP管中,盡快提取送檢[2]。(3)自由基的提取過程把0.4mL乙酸乙酯加入到每個EP管中,混勻。3000rpm,離心10min;把上層無色液體60μL小心吸取到樣品管中,放入ESR波譜儀中測定。測定條件:X波段,400G的掃描寬度,3385G的中心磁場,3.2G的調制幅度,20mW的微波功率,增益:4×105,室溫下測溫。

2.3 數據分析

以均值±標準差形式表示結果,采用方差分析(ANOVA)進行多組間比較,統計學顯著性設定P<0.05。

3 結果

用各組譜線第二峰的高度來表示每組細胞自由基與PBN形成的自旋加合物信號的相對強度。實驗發現與空白組比較,模型組中自旋加合物信號峰值明顯較高,具有顯著性差異,而各個西紅花給藥組信號峰值呈現了不同程度降低,500μg.mL-1和20μg.mL-1信號峰值的降低更為顯著。提示西紅花水提物能夠減少ox-LDL損傷的微血管內皮細胞自由基生成,具有保護內皮細胞免受氧化損傷的作用。

4 討論

目前,檢測自由基最直接和最有效的方法和技術是電子順磁共振(EPR)也叫電子自旋共振(ESR),但是對自由基的要求較高,首先自由基必須相對穩定,而且要達到一定濃度才能用電子順磁共振(EPR)技術檢測。而實際上,化學反應中及生物體系內產生的自由基大部分是不穩定的,自旋捕集技術則因不受其限制解決了這一技術上的難題。自旋捕集技術就是為了檢測和辨認短壽命自由基,將一種不飽和的抗磁性物質加入要研究的反應體系,生成壽命較長的自旋加合物,便于用ESR檢測[3]。

鑒于本實驗是對細胞中的自由基進行檢測,難免受到血清、培養基、溫度和氧氣等因素的干擾,所以選擇 PBN作為本實驗的自旋捕集劑比較合適,能相對客觀地表現出細胞受到氧化損傷時,氧化應激形成的自由基信號的強弱。本實驗發現西紅花水提物500μg.mL-1和20μg.mL-1的組細胞懸液中自由基信號明顯減弱,即模型組與對照組間有顯著性差異(P<0.05),進一步揭示了西紅花水提物抗ox-LDL損傷的可能機制。

[1]黃元慶,魯建華.枸杞總黃酮類化合物抗脂質過氧化研究[J].衛生研究,1999,28(2):115～116.

[2]徐叔云,卞如濂,陳修.藥理實驗方法學[M].第3版.北京:人民衛生出版社,2002:1202.

[3]伍靜,姚尚龍,楊艷,等.異丙酚對鼠心肌細胞缺氧/復氧損傷中的保護作用[J].中華麻醉學雜志,2002:112.