表達大腸桿菌谷氨酸-1-半醛氨基轉移酶對紅色熒光報告蛋白尿卟啉原Ⅲ甲基化酶的影響

葉愛華，張寬亮1,，陳宗梅1,，榮亮1,，汪苗1,，范軍1,

1 安徽農業大學 省級作物生物學重點實驗室，合肥 230036 2 安徽農業大學生命科學學院，合肥 230036

生物四吡咯分子，如血紅素、葉綠素、維生素B12和西羅血紅素，合成的共有途徑中第一個中間物是5-氨基乙酰丙酸 (5-Aminolevulinic acid，ALA)。在動物、真菌和光合細菌中，ALA由ALA合酶催化；在植物和大部分微生物中，ALA來自谷氨酸的碳骨架。首先合成谷氨酰tRNA，隨后，它被還原酶催化生成谷氨酸-1-半醛 (Glutamate-1-semiadhyde，GSA)，谷氨酸-1-半醛氨基轉移酶 (GSA aminotransferase，GSAT) 催化GSA分子內轉氨合成ALA。從ALA到尿卟啉原Ⅲ是所有生物合成四吡咯分子的共有途徑，尿卟啉原Ⅲ的轉化有 2個分支反應，一條途徑最終合成血紅素和葉綠素等卟啉類化合物；另一條途徑由尿卟啉原甲基化酶(Uroporphyrinogen Ⅲ methyltransferase ，UPMT) 催化，最終合成西羅血紅素和維生素B12等卟吩烷化合物。其中，ALA合成和UPMT催化的反應是四吡咯分子合成關鍵調節位點[1]。

大腸桿菌GSAT由hemL基因編碼，一旦突變導致功能喪失，細菌的生長依賴于體外添加ALA，否則細胞死亡[2]。重組純化的大腸桿菌 GSAT活性被3-氨基-2,3二羥基苯甲酸抑制[3]。谷氨酰tRNA還原酶是ALA合成的關鍵酶，受血紅素的反饋抑制，它和 GSAT相互作用，調節 ALA合成[4]。聚胞藻Synechococcus GSAT突變蛋白對抑制劑不敏感[5]，其編碼基因作為植物轉基因的篩選標記[6-7]。

細菌UPMT的基因命名較多，主要有cobA和CysGA等。大腸桿菌重組表達 cobA基因，細胞積累催化產物，菌落在紫外光照射下顯示強烈紅色熒光[8]，這種特性用于克隆細菌cobA基因以及合成尿卟啉原Ⅲ的基因簇[9-10]。cobA及其下游維生素B12合成基因在大腸桿菌共同表達，用于分析酶活性[11-12]。作為報告基因，cobA用于分析細菌、酵母和哺乳動物細胞中的轉錄水平[13]，根據插入失活篩選克隆外源基因的重組子[14]，以及分析細菌的基因啟動子效應[15]。最近發現，表達cobA基因可以增加大腸桿菌對碲酸鹽毒性的抵抗力[16]。

大腸桿菌表達 cobA基因產生的紅色熒光存在熒光滯后和均一性差等缺點[14,17]，添加ALA能提高胞內UPMT的活性，縮短熒光滯后時間，提高細胞的熒光強度[16,18]，但是會導致大腸桿菌積累血紅素合成的中間物，對照菌落也產生紅色熒光[13]，此外，ALA在溶液中不穩定[19]。目前，cobA作為報告基因的影響因子研究報道較少。由于GSAT和UPMT兩個都是標記蛋白，分別位于西羅血紅素合成的關鍵調節酶，因此，它們之間的協調作用需要深入研究。

大腸桿菌僅含有血紅素和西羅血紅素，表達ALA合成相關的酶，增加細胞內 ALA以及尿卟啉原Ⅲ含量[20-21]，但表達GSAT的胞內效應未見報道。此前，筆者發現純化的玉米UPMT結合其催化的紅色熒光產物，而純化的一些細菌UPMT不結合，表明玉米UPMT更適合作為報告蛋白，用于體外分析[22]。本研究中，將大腸桿菌GSAT和玉米UPMT共同表達，研究GSAT對報告蛋白UPMT的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質粒、菌株和試劑

本研究保存的質粒見表 1，大腸桿菌菌株XL-Blue和 BL21 (DE3) 感受態細胞購自北京全式金生物技術公司，酵母浸出物和胰蛋白胨是英國Oxoid公司產品，異丙基硫代-β-D-半乳糖苷 (IPTG)購自美國 Promega公司，3-氨基-2,3二羥基苯甲酸(Gabaculine)、DEAE-Sepharose CL-6B和Ni-NTA是美國 Sigma-Aldrich公司產品，Strep-tag抗體和His-tag抗體是美國Novagen公司產品，其他分子生物學試劑為大連寶生物公司生產。

1.1.2 儀器

紫外可見分光光度儀 U-2001和高速冷凍離心機SCR20BC是日本Hitachi公司產品，凝膠成像系統由日本Kodark公司生產，蛋白質電泳和轉移裝置購自美國Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 基因克隆

CTAB法提取大腸桿菌基因組DNA，以此為模板，擴增 hemL基因，引物見表 1，擴增產物插入pUC-18T 載體，測序。采用同義突變去除hemL基因內Nco I作用序列，PCR擴增，電泳檢測擴增產物，用限制性內切酶DpnⅠ消化12 h，除去模板，然后轉化大腸桿菌XL-Blue，挑選克隆，測序。PCR擴增玉米upmt基因，產物瓊脂糖電泳檢測后純化，用相應的限制性內切酶作用，再純化。

1.2.2 表達載體構建

構建的載體及命名見表 2。將擴增的玉米 upmt基因插入pET Duet-1質粒第2個順反子，構建pETU載體；將大腸桿菌hemL基因插入pET-51b質粒，構建p51eG載體；NcoⅠ和Hind Ⅲ酶切p51eG質粒的hemL基因，插入 pETU質粒第 1個順反子，構建pETeGU載體。

1.2.3 重組菌株誘導表達

不同表達載體轉化到大腸桿菌 BL21(DE3)，在LB培養基中加入100 μg/mL的氨芐青霉素，37℃培養12 h，按照1∶200稀釋，待菌體濃度生長至OD600約為0.5時，加入IPTG，終濃度為0.4 mmol/L，37℃誘導5 h，6 000×g離心10 min收集菌體，超聲破碎，加入裂解緩沖液 (100 mmol/L的Tris-HCl，pH 8.0)，超聲破碎，15 000×g離心30 min，棄沉淀，上清液備用。

表1 PCR擴增引物及序列Table 1 PCR primers used in this study

表2 本研究所用載體Table 2 Plasmids used in this study

1.2.4 蛋白分析

蛋白濃度測定采用考馬斯亮藍G-250方法，以BSA作對照。蛋白 SDS-PAGE分析，分離膠為12.5%，電泳完畢后轉移到 PVDF膜，轉移效果用麗春紅顯示，1×TBS/0.2% 戊二醛固定40 min，加10 mL封閉液封閉1 h阻斷非特異性結合部位，分別加入10 μL 按1∶2 000稀釋的Strep·TagⅡ或者組氨酸標簽的單克隆抗體，室溫孵育過夜。Western漂洗液漂洗3次，加10 mL封閉液及按1∶2 000稀釋的HRP標記第二抗體10 μL，孵育1 h后漂洗3次，加1 mL化學發光劑，置入暗室用X光膠片曝光，然后顯影，定影。

1.2.5 重組細胞的熒光色素分析[22]

不同表達載體轉化大腸桿菌 BL21 (DE3)，在LB固體培養基上37℃生長15 h，長紫外光下觀察菌落熒光。pETeGU質粒轉化大腸桿菌，在1 L LB培養基中誘導表達后，收集菌體，破碎細胞，上清液用DEAE-Sepharose CL-6B (3 cm×3 cm) 吸附，裂解緩沖液沖洗5個柱體積，加入20 mL的洗脫緩沖液 (20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，3 mol/L NaCl) 洗脫，立即進行300~700 nm光譜掃描。

2 結果

2.1 基因擴增及突變

利用NEBcutter V2.0軟件預測基因的限制性內切酶作用序列，設計不同引物 (表 1)，分別擴增不同基因。根據Expasy中Translate tool軟件分析大腸桿菌hemL基因編碼的氨基酸序列，采用同義突變技術去除hemL基因的Nco I序列，引物突變序列不改變大腸桿菌密碼子的偏愛性。

利用PCR技術，從大腸桿菌基因組DNA中擴增出hemL基因，約1.3 kb (圖 1)，測序結果和公布的序列一致，由于在pET-51b質粒表達的蛋白N端含有Strep·TagⅡ標簽，所以表達的GSAT刪除第1個Met殘基。

以本實驗室已構建的含有玉米upmt基因p31S1載體為模板 (表2) 進行PCR擴增，產物約為880 bp (圖2)，編碼N端組氨酸標簽和玉米UPMT的Leu91-Ser363。玉米 UPMT前體含有葉綠體導肽，刪除 N端和C端一段氨基酸序列，對其功能影響不大[22]。

圖1 大腸桿菌hemL的PCR擴增Fig. 1 Escherchia coli hemL gene obtained by PCR. 1: DL5000 DNA marker; 2: E. coli hemL gene.

圖2 玉米upmt基因的PCR擴增Fig. 2 PCR analysis of maize upmt gene encoding Leu91-Ser363 amino acid sequence with His6-tag at N terminus. 1: DL2000 DNA marker; 2: maize upmt gene.

2.2 載體構建

本研究構建數個載體 (表 2) 用于基因克隆和表達。分別把大腸桿菌hemL基因和玉米upmt基因插入pET Duet -1質粒的第1和第2個順反子，表達重組蛋白分別含有Strep·TagⅡ和組氨酸標簽。N端組氨酸標簽對大腸桿菌GSAT和玉米UPMT的活性沒有影響[4,22]。

2.3 GSAT和UPMT蛋白在大腸桿菌的表達水平

分別轉化 pETU質粒和 pETeGU質粒，重組UPMT的表達水平沒有顯著變化 (圖 3)，同時檢測發現大腸桿菌GSAT也能高效表達，表明pETDuet-1質粒的2個表達單元中每個啟動子對下游基因的表達都起作用。

圖3 UPMT和GSAT的可溶性蛋白印跡分析Fig. 3 Western blotting analysis of the soluble UPMT and GSAT. Lane 1 and 2 represented the expression of UPMT extracted from the induced E. coli BL21 (DE3) cells carrying pETU plasmid or pETeGU plasmid. Lane 3 represented the expression of GSAT from the induced cells carrying pETeGU plasmid.

2.4 表達GSAT和UPMT對菌落熒光的影響

將pETU質粒轉化大腸桿菌，沒有IPTG誘導，菌落不顯示紅色熒光，但是誘導后菌落顯示紅色熒光 (表3)。無論重組pUC18質粒中Lac啟動子下的細菌cobA基因，還是重組pQE31質粒中T5啟動子下的玉米upmt基因，其本底表達導致菌落顯示紅色熒光[13,22]，表明菌株和質粒的不同啟動子導致UPMT的表達存在差異。

含有pETeGU質粒的大腸桿菌依賴UPMT的本底表達，菌落顯示紅色熒光。誘導后，細胞熒光強度高于轉化pETU質粒細胞的強度 (表3)，由于兩種重組細胞中UPMT的表達水平接近 (圖3)，推測表達GSAT促進ALA的合成，提高細胞內尿卟啉原Ⅲ水平。

表3 轉化不同載體的重組大腸桿菌熒光展示Table 3 Fluorescent display from the recombinant E. coli carrying the different plasmid respectively

2.5 GSAT的抑制劑對誘導的重組菌落熒光的影響

添加2 mmol/L的GSAT抑制劑3-氨基-2,3二羥基苯甲酸，表達GSAT和UPMT的重組菌落熒光消失 (圖 4)。該抑制劑能穿過大腸桿菌細胞，抑制ALA合成，同時對重組聚胞藻GSAT和橙色綠屈撓菌 Chloroflexus aurantiacus蛋白的表達基本沒有影響[5,23]，可能ALA合成被抑制，尿卟啉原Ⅲ的含量降低，導致熒光消失，不加抑制劑的菌落顯示強烈紅色熒光，表明增強胞內ALA的合成比在體外添加ALA對UPMT的熒光效果好。大腸桿菌hemB-突變體不能合成尿卟啉原Ⅲ，表達UPMT后，菌落不顯示紅色熒光[24]，表明UPMT的熒光依賴內源底物尿卟啉原Ⅲ的含量。

2.6 重組細胞的熒光物質分析

轉化pETeGU質粒的重組細胞呈紅色，光譜掃描純化的上清液，顯示在354 nm和378 nm有2個吸收峰 (圖 5)，分別是三甲基咕啉和西羅雙氫葉綠三酸的特異光吸收，是重組UPMT催化產生的主要熒光物質[8]，這和表達玉米UPMT的結果一致[22]。體外添加 ALA能增加血紅素合成中間物卟啉原的含量，它們容易氧化產生尿卟啉和糞卟啉等化合物，在405 nm有吸收峰[21]，本研究并未檢測到，可能是重組GSAT對提高ALA合成的能力有限，以及重組表達UPMT導致大腸桿菌尿卟啉原Ⅲ的代謝流向發生改變。

圖4 濃度為2 mmol/L的3-氨基-2,3二羥基苯甲酸對誘導含有pETeGU質粒的大腸桿菌菌落熒光的影響Fig. 4 The effect of gabaculine at the concentration of 2 mmol/L on the red fluorescence from the induced colonies harboring pETeGU plasmid on LB agar plate upon UV light illumination.

圖5 轉化不同質粒的大腸桿菌誘導細胞破碎上清液的光譜掃描，圖上標注為轉化的質粒名稱Fig. 5 UV-visible spectra of the extracts from the induced E. coli cells carrying the different plasmids (denoted on the figure). The specific absorption at 354 nm and 378 nm represent trimethylpyrrocophin and sirohydrochlorin respectively.

3 討論

本研究中，我們選擇了具有雙順反子的載體，每個順反子都有自己獨立的啟動子和核糖體結合位點，選擇表達的蛋白標簽序列較短，避免抑制酶活性，便于檢測。由于GSAT活性測定誤差較大[25]；以及尿卟啉原Ⅲ和UPMT的催化產物難以區分[24]，我們沒有分析重組 GSAT的比活和胞內尿卟啉原Ⅲ的含量。

UPMT作為指示蛋白，從理論上推測，其熒光強度可能與蛋白表達水平、內源底物濃度、熒光產物的穩定性以及表達系統有關[13]，表達UPMT導致代謝流向改變，可能降低大腸桿菌血紅素含量，解除了它對谷氨酰 tRNA還原酶的反饋抑制[14]。本研究中，表達大腸桿菌GSAT，可能提高ALA合成能力，ALA被大腸桿菌基因組編碼的合成血紅素一些酶轉化成尿卟啉原Ⅲ[21]，它被重組表達的UPMT催化，從而提高轉化細胞的熒光強度。

血紅素合成的一些卟啉類中間物，例如尿卟啉原Ⅲ，可以作為治療癌癥的藥物[21]。大腸桿菌高效合成尿卟啉原Ⅲ，需要重組表達 4個酶，不同蛋白的表達水平差異導致細胞的尿卟啉原Ⅲ濃度不同，需要重組細菌長時間培養和HPLC技術分析才能確定[21]，已發現，體外添加ALA濃度和大腸桿菌表達UPMT產生的熒光強度成正相關[15]，UPMT能否檢測細胞內尿卟啉原Ⅲ的含量，有待進一步研究。

植物質體轉化中，氨基糖苷-3′-腺苷酸轉移酶的 aadA基因和綠色熒光蛋白的基因位于一個雙順反子，作為雙功能標記用于轉基因后代的篩選和檢測[26]。甜菜堿醛脫氫酶基因不僅作為質體轉化篩選標記，還提高轉基因植物的抗旱性[27]。植物在葉綠體中不但合成四吡咯分子，而且合成類胡蘿卜素。研究發現，轉基因玉米的類胡蘿卜素含量隨著轉化基因數目增加而升高[28]。西羅血紅素作為植物亞硝酸還原酶和亞硫酸還原酶的輔基，參與植物氮和硫的同化，亞硝酸鹽誘導玉米幼苗中 upmt基因的表達[29]。GSAT和UPMT作為西羅血紅素合成2個關鍵蛋白，它們的編碼基因能否在轉基因植株中作為標記并增加西羅血紅素的產量，正在深入研究。

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