雙篩選標(biāo)記打靶載體的構(gòu)建及其功能鑒定

李軍華，韓翠芹，鄧捷，王華巖

西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 陜西省干細(xì)胞工程技術(shù)研究中心 陜西省農(nóng)業(yè)分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，楊凌 712100

生物技術(shù)與方法

雙篩選標(biāo)記打靶載體的構(gòu)建及其功能鑒定

李軍華，韓翠芹，鄧捷，王華巖

西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 陜西省干細(xì)胞工程技術(shù)研究中心 陜西省農(nóng)業(yè)分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，楊凌 712100

利用DNA同源重組方法 (基因打靶) 對(duì)動(dòng)物基因組進(jìn)行修飾是轉(zhuǎn)基因研究的重要手段之一。為了構(gòu)建一個(gè)高效的通用型基因打靶載體，本研究以pBS246質(zhì)粒為骨架，在兩個(gè)LoxP序列之間插入正篩選標(biāo)記新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(neo)基因和綠色熒光蛋白 (EGFP) 基因；在兩個(gè) LoxP序列外側(cè)分別插入兩組攜帶“8堿基”酶切位點(diǎn)的多克隆位點(diǎn)序列(MCS-1和MCS-2) 和負(fù)篩選標(biāo)記單純皰疹病毒胸苷激酶 (HSV-tk) 基因，構(gòu)建成通用型基因打靶載體pGT-V1，并且在C2C12細(xì)胞中驗(yàn)證了載體中各個(gè)元件的功能。該載體具有如下特點(diǎn)：1) 在載體中引入綠色熒光標(biāo)記，可以實(shí)時(shí)監(jiān)控載體的轉(zhuǎn)染效率，而轉(zhuǎn)染效率的提高為高效基因打靶提供了保證；2) 在兩個(gè) LoxP位點(diǎn)間插入綠色熒光標(biāo)記，可以直觀監(jiān)測(cè)打靶后遺留的篩選標(biāo)記的去除情況，并且可以通過流式細(xì)胞儀或免疫磁珠法，將最終去除了篩選標(biāo)記的陽性細(xì)胞(即丟失綠色熒光的細(xì)胞) 分選出來，降低篩選標(biāo)記在中靶細(xì)胞中可能產(chǎn)生的負(fù)面影響；3) 采用“8堿基”酶切位點(diǎn)的MCS序列，便于DNA大片段的連接和重組，極大提高了該載體的通用性。總之，該載體優(yōu)化了基因打靶的技術(shù)手段，為有效開展基因打靶和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究提供了新平臺(tái)。……