牛脂肪間充質干細胞的分離、培養與鑒定

任宇，吳海青，馬玉珍,2，倉明，王瑞，劉東軍

1 內蒙古大學 哺乳動物繁殖生物學與生物技術重點實驗室，呼和浩特 010021

2 內蒙古自治區醫院，呼和浩特 010017

牛脂肪間充質干細胞的分離、培養與鑒定

任宇1，吳海青1，馬玉珍1,2，倉明1，王瑞1，劉東軍1

1 內蒙古大學 哺乳動物繁殖生物學與生物技術重點實驗室，呼和浩特 010021

2 內蒙古自治區醫院，呼和浩特 010017

為了給組織工程提供種子細胞，對牛間充質干細胞 (Adipose-derived stem cells，ADSCs) 進行體外分離培養。首先應用膠原酶消化法分離牛ADSCs，進行體外培養、連續傳代，并觀察細胞的形態變化，通過細胞計數繪制生長曲線，細胞壓片進行染色體分析，采用細胞免疫熒光化學方法檢測細胞表面標記，利用成骨分化和成脂分化檢測其分化能力。結果顯示牛ADSCs體外培養時細胞形態呈成纖維細胞樣，增殖穩定；Vimentin、CD49d、CD13表達呈陽性，CD34表達呈陰性；成骨誘導條件下的細胞堿性磷酸酶活性高，茜素紅染色呈陽性；成脂誘導條件下細胞周圍脂滴明顯，油紅-O染色呈陽性。結果證明牛 ADSCs體外生長穩定、增殖速度快、定向分化能力強，簡易的體外分離培養及誘導方法為其在組織工程中的應用奠定了基礎。

脂肪間充質干細胞，體外分離培養，細胞鑒定，細胞分化

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料

成年牛頸部脂肪組織由內蒙古大學實驗動物研究中心提供。

1.1.2 主要試劑

DMEM/F12 培養基、PBS、胰蛋白酶、雙抗、胎牛血清 (以上藥品均由Hyclone公司提供)；Ⅰ型膠原酶、β-甘油磷酸鈉、地塞米松、抗壞血酸、Alizarin Red、BSA、牛胰島素、生物素、泛酸、羅格列酮、IBMX、Oil Red-O (以上藥品均由Sigma公司提供)；ALP檢測試劑盒 (北京中生生物技術公司) 等。

1.2 方法

1.2.1 牛ADSCs的分離

采用膠原酶解法分離：脂肪組織用PBS沖洗2次，無菌條件下用手術刀切碎脂肪組織，分裝入50 mL離心管中。加入與脂肪組織等體積的PBS (含有 1% BSA，0.1%Ⅰ型膠原酶)，37℃搖床中振蕩酶解60 min，每隔20 min收集一次細胞，1 200 r/min離心5 min，除去上層脂肪組織。最后將3次收集的細胞移至同一離心管內，1 200 r/min離心5 min后棄上清液，基本培養基重懸沉淀，即得到牛脂肪間充質干細胞。

1.2.2 原代培養及傳代培養

按2×105/cm2的接種密度，在60 mm培養皿中加入5 mL基本培養基，于37℃、5% CO2濃度、飽和濕度條件進行培養。48 h后更換培養基，以后隔天換液，當貼壁細胞的生長達到80%匯合時，加入 0.25%胰蛋白酶消化，傳代培養。將擴增后的不同代次牛ADSCs，按0.5×106/mL置于冰凍保存管，加入冰凍保護劑 (10% DMEM，10% DMSO，80% FBS)，置冰凍盒中?80℃冰箱保存24 h后，轉入液氮保存。

1.2.3 牛ADSCs鑒定

牛ADSCs以1×105/mL的密度接種于鋪于24孔板內的蓋玻片上，待細胞生長至80%以上匯合時，4%多聚甲醛室溫固定 30 min，加入滲透液 (0.1% TritonX-100) 室溫滲透1 h，加入封閉液 (PBS+2% BSA+2%山羊封閉血清+2%脫脂奶粉+0.15 MGlycine) 37℃封閉 2 h，然后分別滴加 1∶200 Vimentin (小鼠抗大鼠多克隆抗體，武漢博士德生物)、CD49d (兔抗大鼠多克隆抗體，武漢博士德生物)、CD34 (兔抗大鼠多克隆抗體，武漢博士德生物)和CD13 (兔抗大鼠多克隆抗體，武漢博士德生物)，37℃溫育2 h。清洗一抗后，1∶50加入山羊抗FITC標記二抗37℃溫育2 h，最后PBS+BSA清洗二抗PI染色15 min，同時以PBS代替一抗和牛成纖維細胞作為陰性對照，共聚焦顯微鏡 (BX61，奧林巴斯，日本) 觀察細胞染色情況。

1.2.4 生長曲線

傳代培養的第5、10代細胞用普通培養液制成單細胞懸液，調整細胞濃度為1×104/mL，接種于24孔培養板，每孔1 mL，第2天起每天取3孔細胞計數。以時間 (d) 為橫坐標，細胞數量(×104/mL)為縱坐標，繪制生長曲線。

1.2.5 染色體分析

取第5、10代處于指數生長期的牛ADSCs，加入含0.1 μg/mL秋水仙素 (Sigma) 的DMEM-F12培養4 h。0.25%胰酶消化收集細胞，逐滴加入37℃預熱的0.075 mol/L KCl 5 mL，37℃低滲處理20 min。低滲結束后加入新配制固定液 (甲醇∶冰醋酸= 3∶1) 1 mL，預固定1 min后1 000 r/min離心10 min，棄去上清液，加固定液懸浮細胞后靜置30 min，再離心，固定2次，每次30 min。離心后加固定液1.5 mL制成細胞懸液。用微吸管取細胞懸液滴于?20℃冰凍的載玻片上，空氣干燥，1∶9姬姆薩(Sigma) 磷酸緩沖液染色 15 min，清水洗滌后顯微鏡下觀察。

1.2.6 成骨分化誘導

培養24 h細胞貼壁后，置換成骨誘導培養基進行培養，每3天更換一次新鮮分化培養基 (DMEM/ F12+10% FBS+1%雙抗+10 mmol/L β-甘油磷酸鈉+20 nmol/L地塞米松+50 μg/mL抗壞血酸) 進行成骨誘導。對照組繼續加入常規培養基每3天更換一次新鮮培養基，與誘導組在同一條件下培養，21 d后進行相應檢測。

1.2.7 成脂分化誘導

培養24 h細胞貼壁后，培養板中加入成脂誘導培養基 (DMEM/F12+3% FBS+1%雙抗+33 μmol/L生物素+17 μmol/L泛酸+1 μmol/L胰島素+1 μmol/L地塞米松+0.5 mmol/L IBMX+5 μmol/L羅格列酮+ 5%兔血清) 培養3 d，然后換為無羅格列酮和IBMX的維持培養基繼續培養，每 3天更換一次新鮮分化培養基。對照組繼續加入常規培養基每3天更換一次新鮮培養基，與誘導組在同一條件下培養，21 d后進行相應檢測。

1.2.8 成骨細胞鑒定

茜素紅染色：誘導培養 21 d的細胞，用150 mmol/L NaCl沖洗3次，在4℃下用70%乙醇固定1 h，室溫下用2%茜素紅 (NaOH調pH 4.1~4.3)染色10 min，相差顯微鏡檢測鈣鹽沉積情況。

堿性磷酸酶(Alkaline phos phatase，ALP)染色：將成骨誘導培養21 d的細胞PBS沖洗2次，4℃下用 100%乙醇固定1 h，加入NBT/BCIP溶液溫育后檢測ALP活性。

PCR鑒定骨鈣素 (Osteocalcin) 的表達：TaKaRa RNAiso reagent裂解成骨細胞，氯仿抽提總RNA溶于DEPC水中，利用反轉錄試劑盒將RNA反轉錄為cDNA進行 PCR。引物由大連寶生物公司合成 (表1)。PCR 參數：94℃ 4 min；94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 30 s，35個循環；72℃ 10 min，4℃保存。

表1 本研究中所用引物Table 1 Primers used in this study

1.2.9 成脂細胞鑒定

油紅-O染色：誘導培養后的細胞，室溫下用10%福爾馬林固定20 min，加入油紅-O染色20 min。相差顯微鏡下檢測成脂分化結果。

PCR鑒定PPARγ2的表達：目的基因引物序列見表1 (其余同上，PCR鑒定Osteocalcin的表達)。

2 結果

2.1 形態學觀察

牛ADSCs 接種后4~6 h開始貼壁，初為小圓形，細胞大小不均勻，有部分單核細胞存在。48 h后逐漸伸展為短梭形、多角形和長梭形，細胞折光度較好，4 d后形態呈成纖維細胞樣 (圖1)，8~10 d達到80%~85%匯合。傳代后牛ADSCs呈典型成纖維細胞樣生長 (圖2)。

2.2 牛ADSCs鑒定

FITC熒光信號呈綠色，激發波長488 nm，在波長 530 nm以上觀察。第 5代牛 ADSCs細胞Vimentin、CD49d和CD13均勻染色呈陽性，CD34呈陰性。以PBS代替一抗和牛成纖維細胞為陰性對照，以上抗體染色均呈陰性 (圖3)。

圖1 原代牛ADSCs形態觀察 (100×)Fig. 1 Morphology of primary bovine ADSCs (100×).

圖2 第5代牛ADSCs形態觀察 (100×)Fig. 2 Morphology of P5 bovine ADSCs (100×).

圖3 牛ADSCs免疫組織化學染色結果Fig. 3 Results of ADSCs immunofluoresence staining. (A-D) Bovine ADSCs. (E-H) Bovine fibroblasts. (A, E) Vimentin staining. (B, F) CD49 staining. (C, G) CD13 staining. (D, H) CD34 staining. (A1-H1) A-H corresponding to excited without excitation of the original map.

2.3 生長曲線

從圖4中可以看出，第5、10代的牛ADSCs生長曲線基本符合細胞生長曲線規律，經歷了潛伏期、對數期、平臺期，分別為1 d、2~6 d、6~8 d后。說明牛ADSCs在體外增殖穩定，生長狀態無異常。

圖4 牛ADSCs生長曲線Fig. 4 Growth curve of bovine ADSCs.

2.4 染色體分析

經消化收取細胞進行染色體分析，第 5代牛ADSCs有90% (27/30) 細胞的染色體具有正常二倍體倍性 (圖 5)，第 10代牛 ADSCs有 84% (25/30) 細胞的染色體仍具有正常二倍體倍性 (圖6)，說明牛脂肪間充質干細胞在體外生長染色體正常 (圖5)。

2.5 誘導分化

2.5.1 成骨誘導分化

牛ADSCs成骨誘導后，第10~14天已具有較強成骨活性，21 d后實驗組細胞結節中心的細胞逐漸融合失去細胞結構，骨化結形成明顯。經茜素紅染色呈暗紅色 (圖 7A箭頭所指處)，對照組細胞經過21 d培養后仍然呈成纖維細胞樣生長，細胞無堆積現象出現，茜素紅染色后無暗紅色骨化結出現 (圖7B)，ALP染色實驗組細胞呈陽性，細胞著色程度不一，呈藍紫色，且細胞密集處著色更深 (圖8A箭頭所指處)，ALP陽性率可到85%以上說明有大量成骨細胞形成，而對照組細胞經ALP染色后細胞無明顯著色，呈陰性 (圖8B)。骨鈣素是骨組織的特異性蛋白，是骨細胞分化成熟的標志，在牛ADSCs中不表達 (如圖9A中泳道3所示)，在成骨細胞中表達 (如圖9B中泳道3所示)。以上結果均說明牛間充質干細胞在成骨誘導體系下已經向成骨細胞分化。

圖5 F5ADSCs染色體 (1 000×)Fig. 5 Chromosomes of F5ADSCs (1 000×).

圖6 F10ADSCs染色體 (800×)Fig. 6 Chromosomes of F10ADSCs (800×).

圖7 牛ADSCs成骨誘導21 d后茜素紅染色 (100×)Fig. 7 Alizarin Red Staining of bovine ADSCs after osteogenic induction on 21th day (100×). (A) Experimental group. (B) Control group.

圖8 牛ADSCs成骨誘導21 d后堿性磷酸酶染色 (100×)Fig. 8 ALP Staining of bovine ADSCs after osteogenic induction on 21th day (100×). (A) Experimental group. (B) Control group.

圖9 牛ADSCs電泳結果Fig. 9 Electrophoresis of bovine ADSCs. (A) Electrophoresis of GAPDH. (B) Electrophoresis of osteoblasts. (C) Electrophoresis of adipocyte. 1: 200 bp marker (TaKaRa); 2: GAPDH (360 bp); 3: Osteocalcin (424 bp); 4: PPARγ2 (564 bp); 5: negative control.

2.5.2 成脂誘導分化

牛ADSCs成脂誘導后實驗組細胞周圍分泌出多邊形、梭形微小油滴，小油滴可慢慢聚合變大，經油紅-O染色后呈紅色 (圖10A箭頭所指處)，而細胞并不會被著色，對照組細胞21 d后細胞形態無異常表現，周圍無油滴出現，細胞沒有向脂肪細胞分化的跡象，經油紅-O染色后無顯色反應出現 (圖10B)。過氧化物酶體增殖物激活受體 (PPARγ2)與胰島素抵抗、脂肪細胞分化和肥胖有密切關系。PPARγ2是前脂肪細胞分化為成熟脂肪細胞以及脂肪細胞內甘油三酯蓄積的重要調節因子，在牛 ADSCs中不表達(如圖9A中泳道4所示)，而在脂肪細胞中表達 (如圖9C中泳4道所示)，以上結果均說明牛脂肪間充質干細胞在成脂誘導體系下已經向脂肪細胞分化。

圖10 牛ADSCs成脂誘導21 d后油紅-O染色 (100×)Fig. 10 Oil Red-O Staining of bovine ADSCsafter adipogenesis introduction on 21th day (100×). (A) Experimental group. (B) Control group.

3 討論

自體脂肪組織因具有來源豐富、取材安全、無免疫排斥反應的特點，成為21世紀理想的軟組織填充材料。但是，多年來移植脂肪組織顆粒仍存在高吸收率和低存活率的問題，至今仍無突破性進展。自2001年Zuk等[3]研究發現，脂肪組織中含有可分化為脂肪細胞、成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞等具有較強的增殖能力和多向分化潛能的細胞，被稱為ADSCs。人們分別從人[4-6]、小鼠[7]、大鼠[8]、兔[9]和豬[10]等動物體內分離得到類似的ADSCs。目前對于牛、羊等家畜動物的相關研究涉及很少，本研究分離得到的牛 ADSCs與其他物種的脂肪間充質干細胞形態及生長特點相似，同樣具有多向分化潛能。

為了排除紅細胞的干擾，人們常使用 NH4Cl裂解紅細胞。鑒于紅細胞不貼壁的特性，本研究中通過二次換液去除紅細胞，效果明顯且與使用 NH4Cl裂解紅細胞并無明顯差異，同時簡略了細胞分離培養步驟，減少細胞在外界的操作時間。眾所周知，ADSCs目前尚無特異的表面標記，本研究測定了Vimentin、CD49d、CD13和CD34四個因子。Vimentin是 5種主要的中間絲之一，存在于各種正常和病理性間質來源的組織，本研究中牛ADSCs Vimentin染色呈陽性，說明所分離得到的牛ADSCs是來源于中胚層的干細胞。CD49d是調節造血干細胞和祖細胞定居歸巢到骨髓的表面分子，CD49d和CD106是脂肪間充質干細胞和骨髓間充質干細胞的很好的區分標記[11-12]。CD34是造血干細胞的表面標記在淋巴結、骨髓造血干細胞和各種內皮中表達，CD34陰性說明牛 ADSCs 并非來源于血液循環中的干細胞，同時說明牛 ADSCs 未受到脂肪組織中微血管內皮細胞的污染。以上結論說明已經得到純度較高的牛ADSCs。本研究所用的細胞表面分子的檢測可用于鑒定牛脂肪間充質干細胞。但最好的方法是進行多向誘導，并進行相應檢測以確定誘導成功。

細胞基質中鈣鹽沉積情況最直接反映了細胞成骨的程度，茜素紅具因其具有有羥基蒽醌結構，與鈣鹽中的鈣離子結合后形成配合物顯示為紅色[13-14]，是用于測定細胞基質中鈣鹽沉積的一種較特異和常用的方法。ALP是成骨細胞分化的標志，在體外鈣化中起關鍵性作用。目前認為，ALP能夠水解有機磷酸酯，使局部 PO43?濃度升高，并可破壞鈣化抑制劑，從而啟動鈣化。ALP活性越高，說明牛ADSCs向成熟成骨細胞分化越明顯，隨著ALP活性的提高，鈣鹽沉積在膠原纖維上，形成骨化結。成骨細胞特異表達基因骨鈣素在牛 ADSCs和成骨細胞的差異表達，在分子水平上說明牛 ADSCs已發生成骨分化。Hattori等[15]用β-磷酸三鈣復合體作為經向成骨誘導的ADSCs的支架放至裸鼠皮下，發現有骨組織形成，提示 ADSCs 在脂肪組織工程中有廣闊的應用前景。Hong 等[16]用凝膠海綿作支架在體外進行人ADSCs成脂分化的三維培養，并用油紅-O染色法進行鑒定，經過短期培養后與凝膠海綿一起移植至免疫耗竭的小鼠背部，4周后用生物化學和免疫組織化學的方法證實移植物轉變為脂肪組織，認為人 ADSCs結合生物相容并與可降解的凝膠海綿進行脂肪組織工程是可行的。本研究中油紅-O染色及PCR結果同樣證實牛ADSCs可分化為脂肪細胞。那么，本研究中牛ADSCs在體外可以分化為成骨細胞和脂肪細胞，是否在動物體內具有同樣的作用，還需要進一步證實。

本研究培養的牛ADSCs在體外培養取材容易，對機體損傷小，分離方法簡便，體外生長增殖能力強，經多次傳代后細胞仍生長穩定、增殖速度快、貼壁率高，并且可以定向誘導分化為成骨細胞和脂肪細胞，填補了ADSCs在牛羊等家畜動物研究方面的空缺，因此有望成為脂肪組織工程和基因治療的一種很好的細胞來源。

REFERENCES

[1] Chen TL. Inhibition of growth and differentiation of osteoprogenitors in mouse bone marrow stromal cell cultures by increased donor age and glucocorticoid treatment. Bone, 2004, 35(1): 83–95.

[2] Jü HB. In vitro experiment about osteogenic differentiation of the mesenchymal stemcell from lipose and bone marrow tissue in rats [D]. Changsha: Central South University, 2006.鞠洪斌. 大鼠脂肪間充質干細胞和骨髓間充質干細胞成骨分化比較的體外研究[D]. 長沙: 中南大學, 2006.

[3] Zuk PA, Zhu M, Mizuno H, et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Eng, 2001, 7(2): 211–228.

[4] Aust L, Devlin B, Foster SJ, et al. Yield of human adipose-derived adult stem cells from liposuction aspirates. Cytotherapy, 2004, 6(1): 7–14.

[5] Baksh D, Song L, Tuan RS. Adult mesenchymal stem cells: characterization, differentiation and application in cell and gene therapy. Cell Mol Med, 2004, 8(3): 301–316.

[6] Sakaguchi Y, Sekiya I, Yagishita K, et al. Comparison of human stem cells derived from various mesenchymal tissues: superiority of synovium as a cell source. Arthritis Rheum, 2005, 52(8): 2521–2529.

[7] Ali AA, Weinstein RS, Stewart SA, et al. Rosiglitazone causes bone loss inmice by suppressing osteoblast differentiation and bone formation. Endocrinology, 2005, 146(3): 1226–1235.

[8] Nishida T, Kubota S, Kojima S, et al. Regeneration of defects in articular cartilage in rat knee joints by CCN2 (connective tissue growth factor). Bone Miner Res, 2004, 19(8): 1308–1319.

[9] Liu YM, Zhang ZQ, Yang XF, et al. Isolation, culture and characterization of rabbit adipose-derived stromal cells. Acta Agric Boreali-Occidentalis Sin, 2009, 18(5): 43–47.劉玉梅, 張自強, 楊雪峰, 等. 兔脂肪間充質干細胞分離培養及鑒定. 西北農業學報, 2009, 18(5): 43–47.

[10] Zhang GH, Qu CQ, Yang GS. Culture and adipogenesis differentiation of porcine adipose mesenchymal stem cells. Acta Zool Sin, 2006, 52(5): 934–941.張國華, 屈長青, 楊公社. 豬脂肪間充質干細胞的分離培養及其成脂分化. 動物學報, 2006, 52(5): 934–941.

[11] Strem BM, Hicok KC, Zhu M, et al. Multipotential differentiation of adipose tissue-derived stem cell. Keio J Med, 2005, 54(3): 132–141.

[12] Katz AJ, Tholpady A, Tholpady SS, et al. Cell surface and transcriptional characterization of human adipose-derived adherent stromal ( hADAS) cells. Stem Cells, 2005, 23(3): 412–423.

[13] Perinpanayagam H, Schneider G, Holtman K, et al. Altered Cbfal expression and biomineralization in an osteosarcoma cell line. Ort Res, 2004, 22(2): 404–410.

[14] Vilmann H. The in vivo staining of bone with alizarin red S. Anat, 1969, 105(Pt 3): 533–545.

[15] Hattori H, Masuoka K, Sato M, et al. Bone for mation using human adipose tissue-derived stromal cells and abiodegradable scaffold. Biomed Mater Res B Appl Biomater, 2006, 76(1): 230–239.

[16] Hong L, Peptan IA, Colpan A, et al. Adipose tissue engineering by human adipose-derived stromal cells. Cells Tissues Organs, 2006, 183(3): 133–140.

Isolation, cultivation and identification of adipose-derived stem cell in bovines

Yu Ren1, Haiqing Wu1, Yuzhen Ma1,2, Ming Cang1, Rui Wang1, and Dongjun Liu1
1 Key Laboratory of Ministry of Education of China for Mammal Reproduction Biology and Biotechnology, Inner Mongolia University, Huhhot 010021, China
2 Inner Mongolia Hospital, Hohhot 010017, China

To obtain bovine adipose-derived stem cells (ADSCs), bovine ADSCs were digested in collagenase type I solution. The growth curve of ADSCs was checked by cell counting. Chromosome analysis was checked. The molecular markers of ADSCs were detected with immunofluoresence staining. The morphology of ADSCs was identical to fibroblast 1ike and the cells showed active proliferative ability. Vimentin, CD49d and CD13 antigens were detected, but CD34 antigen was negative. Alkaline phosphatase activity was greater in ADSCs during calcification, and Alizarin Red staining was positive. Lipid droplets were apparent around cells during adipogenesis, and Oil Red-O staining was positive. The results demonstrated that ADSCs could be used as seed cells for tissue engineering due to the simple isolation, differentiation and stable and active growth.

adipose-derived stem cell, cell separation in vitro, cell identification, cell differentiation

近年來，因其具有較強自我增殖能力和多向分化潛能的特點，間充質干細胞 (Mesenchymal stem cells，MSCs) 越來越多地受到人們的關注。現有研究顯示[1]，骨髓間充質干細胞 (Bone marrow stromalstem cells，BMSCs) 可以分化為成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞和成肌細胞等，這些細胞有望成為將來組織工程的種子細胞并為再生醫學作出貢獻。然而，傳統獲取骨髓的方法會給骨髓捐獻者帶來很大的痛苦，同時，通過這種方法得到的BMSCs數量有限、價格昂貴而且易造成細胞污染[2]，這些成為組織工程進一步研究的瓶頸。那么，如何才能解決這一問題？目前大量的目光投向脂肪間充質干細胞(Adipose-derived stem cell，ADSCs)，此類細胞利用簡單的細胞消化法即可獲得，而且取材方便，分離得到的ADSCs數量可觀，體外增殖穩定。與骨髓間充質干細胞相比，它不僅具有相似的表面抗原標記和分化潛能，而且在特定的誘導條件下，同樣可以向 3個胚層的細胞分化。但目前脂肪間充質干細胞在牛羊等家畜動物中少有研究。牛作為我國主要的畜產品動物來源在畜牧業中占有重要地位，對牛的育種改良一直是科研人員工作的重點。目前體細胞克隆和轉基因技術已顯示出在牛的育種改良中具有廣闊的應用前景，那么供體細胞的選擇是否可以提高核移植的成功率以及轉基因效率已成為相關研究領域的重點課題，牛脂肪間充質干細胞以其多能性是否比牛成纖維細胞更適合作為供體細胞，從而提高克隆和轉基因效率是目前的一個研究方向。同時通過建立牛脂肪間充質干細胞系也可以為牛的一些地方病的治療提供研究基礎。本研究體外分離培養牛脂肪間充質干細胞，并對其進行定向誘導，建立牛脂肪間充質干細胞細胞系，為組織工程種子細胞篩選奠定基礎。

July 7, 2010; Accepted: October 13, 2010

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