毛細(xì)管電泳技術(shù)在藥物吸收分析中的應(yīng)用前景

蘇淇，劉曉穎，甘小玲

（重慶醫(yī)藥高等專(zhuān)科學(xué)校藥理教研室，重慶 400030）

現(xiàn)代經(jīng)皮吸收制劑或稱(chēng)經(jīng)皮給藥系統(tǒng)（TTS或TDS）是指在皮膚或黏膜表面給藥，使藥物以恒定速度（或接近恒定速度）通過(guò)皮膚各層或黏膜，進(jìn)入體循環(huán)，產(chǎn)生全身或局部治療作用的新制劑。黏膜給藥主要是指藥物通過(guò)口腔黏膜、眼角膜和結(jié)膜及鼻黏膜等吸收而發(fā)揮治療作用的一種給藥方式。目前對(duì)經(jīng)皮給藥系統(tǒng)的評(píng)價(jià)方法主要有離體和在體方法。經(jīng)皮給藥系統(tǒng)的藥物一般劑量都較小，且不能完全穿透具有多層生物膜結(jié)構(gòu)的皮膚，無(wú)論是在離體或者在體研究中，其吸收程度均不高，同時(shí)存在眾多的干擾物質(zhì)，難以分離純化，因而對(duì)吸收藥物濃度的檢測(cè)要求較高。近年來(lái)，毛細(xì)管電泳（capillary electrophoresis，CE）技術(shù)得到飛速發(fā)展，在常規(guī)藥物分析和其他藥物研究中發(fā)揮著獨(dú)特的作用，它具有高效、快速、微量、多模式、經(jīng)濟(jì)、自動(dòng)化及潔凈等優(yōu)點(diǎn)[1]。筆者擬就毛細(xì)管電泳技術(shù)在經(jīng)皮吸收系統(tǒng)藥物吸收分析中的應(yīng)用前景作一介紹。

1 優(yōu)點(diǎn)

CE技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)可概括為三高二少：高靈敏度，常用紫外檢測(cè)器的檢測(cè)限可達(dá)10-15～10-13mol，激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)器則達(dá)10-21～10-19mol；高分辨率，其每米理論塔板數(shù)幾十萬(wàn)，高者可達(dá)幾百萬(wàn)乃至千萬(wàn)，而高效液相色譜（HPLC）法一般為幾千到幾萬(wàn)；高速度，最快可在60 s內(nèi)完成，250 s內(nèi)分離10種蛋白質(zhì)，1.7 min分離19種陽(yáng)離子及3 min內(nèi)分離30種陰離子；樣品少，只需nL（10-9L）級(jí)的進(jìn)樣量；成本低，只需少量（幾毫升）流動(dòng)相和價(jià)格低廉的石英毛細(xì)管。由于以上優(yōu)點(diǎn)以及分離生物大分子的能力，使CE法成為近年來(lái)發(fā)展最迅速的分離分析方法之一。由于CE法還是一種正在發(fā)展中的技術(shù)，有些理論研究和實(shí)際應(yīng)用正在進(jìn)行與開(kāi)發(fā)。

2 類(lèi)型

CE可分析的成分小至無(wú)機(jī)離子，大至生物大分子，如蛋白質(zhì)、核酸等，可用于分析多種體液樣本如血清或血漿、尿、腦脊液及唾液等，CE分析高效、快速、微量。根據(jù)其分離樣本的原理設(shè)計(jì)不同，主要分為以下幾種類(lèi)型：毛細(xì)管區(qū)帶電泳（CZE），毛細(xì)管等速電泳（CITP），毛細(xì)管膠束電動(dòng)色譜（MECC），毛細(xì)管凝膠電泳（CGE），毛細(xì)管等電聚焦（CIEF）。

3 基本原理

CE 法選用的毛細(xì)管一般內(nèi)徑約 50 μm（20 ～200 μm），外徑375 μm，有效長(zhǎng)度 50 cm（7 ～100 cm），以高壓電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力，以毛細(xì)管為分離通道，其結(jié)構(gòu)包括1個(gè)高壓電源、1根毛細(xì)管、1個(gè)檢測(cè)器及2個(gè)供毛細(xì)管兩端插入而又可和電源相連的緩沖液貯瓶。在電解質(zhì)溶液中，帶電粒子在電場(chǎng)作用下，以不同速度向其所帶電荷相反方向遷移的現(xiàn)象叫作電泳。CE所用的大理石英毛細(xì)管柱，在pH＞3情況下，其內(nèi)表面帶負(fù)電，和溶液接觸時(shí)形成了一雙電層。在高電壓作用下，雙電層中的水合陽(yáng)離子引起流體整體朝負(fù)極方向移動(dòng)的現(xiàn)象叫電滲，粒子在毛細(xì)管內(nèi)電解質(zhì)中的遷移速度等于電泳和電滲流（E0F）兩種速度的矢量和。正離子的運(yùn)動(dòng)方向和電滲流一致，故最先流出；中性粒子的電泳流速度為“零”，故其遷移速度相當(dāng)于電滲流速度；負(fù)離子的運(yùn)動(dòng)方向和電滲流方向相反，但因電滲流速度一般都大于電泳流速度，故在中性粒子之后流出，從而因各種粒子遷移速度不同而實(shí)現(xiàn)分離。

4 在透皮吸收測(cè)定中的應(yīng)用

4.1 樣品收集與處理

若采用離體皮膚對(duì)經(jīng)皮給藥系統(tǒng)進(jìn)行評(píng)價(jià)，其接受液多為生理鹽水，在與皮膚的接觸過(guò)程中，會(huì)有少量皮膚中的雜質(zhì)溶解其中，對(duì)測(cè)定造成干擾。若為在體研究，采取的體內(nèi)樣品如不能立即進(jìn)行分析，則存在樣品的保存問(wèn)題。對(duì)于血樣，在采血后離心或加適宜的抗凝劑后離心，得到血清或血漿樣品，然后置-20℃或以下溫度冷凍保存?zhèn)溆茫粚?duì)于尿樣應(yīng)收集一定時(shí)間內(nèi)的總尿量，以避免藥物的損失，并置冰箱冷藏或加防腐劑后保存。無(wú)論離體或者在體研究，在樣品檢測(cè)前都需進(jìn)行組分的提取、分離、純化、富集，去除蛋白等雜質(zhì)，收集樣品以適應(yīng)檢測(cè)的需要。對(duì)于不同的藥物和檢測(cè)手段，其前處理過(guò)程也不一樣。

近年來(lái)出現(xiàn)了各種在柱預(yù)濃縮技術(shù)，如場(chǎng)放大、電堆積富集、等速電泳聚焦?jié)饪s、固相預(yù)濃縮、膜預(yù)濃縮等，大大提高了CE法的檢測(cè)靈敏度。其中，場(chǎng)放大樣品富集（FASS）技術(shù)操作方便，靈敏度提高顯著，在體內(nèi)藥物分析中應(yīng)用極為廣泛。樣品濃縮技術(shù)是采用特殊的進(jìn)樣過(guò)程將大體積樣品溶液中的痕量被測(cè)物濃縮后進(jìn)行分離，從而提高檢測(cè)靈敏度。毛細(xì)管電泳中的樣品濃縮技術(shù)有柱上濃縮與柱前濃縮之分：柱上濃縮是不改變毛細(xì)管電泳系統(tǒng)時(shí)，將大體積樣品直接引入分離毛細(xì)管，在電泳前采取適當(dāng)?shù)拇胧┻M(jìn)行濃縮，然后直接進(jìn)行電泳分離；柱前濃縮是在改變毛細(xì)管電泳系統(tǒng)時(shí)進(jìn)行，一般在分離毛細(xì)管前增加一段預(yù)柱，大體積樣品首先被引入預(yù)柱中采取適當(dāng)措施進(jìn)行濃縮，然后部分或全部被引入分離毛細(xì)管柱中進(jìn)行分離。作為一種主要的分析技術(shù)，毛細(xì)管電泳的分析對(duì)象也開(kāi)始從以往相對(duì)簡(jiǎn)單的分析體系逐步擴(kuò)展到生物樣品[2]。樣品前處理的效率直接影響到整體分析水平，一般來(lái)說(shuō)，CE技術(shù)較多配合固相萃取技術(shù)（SPE），簡(jiǎn)單、耗樣量少[3]。待測(cè)成分的富集是CE樣品前處理技術(shù)中另一個(gè)關(guān)鍵。納升級(jí)進(jìn)樣量需要相應(yīng)高靈敏度檢測(cè)技術(shù)與之配套。質(zhì)譜分析技術(shù)（MS）是通過(guò)對(duì)樣品離子的質(zhì)量和強(qiáng)度的測(cè)定進(jìn)行定量和結(jié)構(gòu)分析的一種分析方法，具有分析靈敏度高、速度快等優(yōu)點(diǎn)。這兩種技術(shù)的聯(lián)用（CE/MS）綜合二者優(yōu)點(diǎn)成為分析生物大分子物質(zhì)的有力工具。最新發(fā)展了一系列的預(yù)富集方法，如柱上等速電泳富集法、樣品堆積技術(shù)以及膜富集或固相富集等技術(shù)，以增強(qiáng)濃度靈敏度。例如Chiang等[4]對(duì)比了兩種毛細(xì)管電泳富集技術(shù)，采用以磷酸、SDS、二乙胺和乙腈溶液進(jìn)行沖掃（sweeping method）的方法可檢測(cè)到質(zhì)量濃度低至0.1 μg/mL的水平，而同時(shí)采用陽(yáng)離子選擇性耗盡（cation-selective exhaustive）進(jìn)樣技術(shù)和膠束電動(dòng)色譜沖掃（CSEI.sweep.MEKC）技術(shù)，可以使檢測(cè)限達(dá)到1×10-3μg/mL。

4.2 分析方法

經(jīng)皮給藥系統(tǒng)的體內(nèi)分析法大體分為直接法和間接法。直接法即直接測(cè)定經(jīng)皮給藥后的體內(nèi)藥物及代謝物濃度，這對(duì)了解藥物的體內(nèi)過(guò)程具有直接的意義；間接法主要通過(guò)測(cè)定標(biāo)記藥物在生物樣品的放射活性，間接獲得藥物在體內(nèi)的作用過(guò)程。如在月桂氮酮的促滲透機(jī)制研究中，用14C進(jìn)行標(biāo)記，液閃法測(cè)定尿樣放射活性，得到單劑量和多劑量月桂氮酮的經(jīng)皮吸收數(shù)據(jù)[5]。也可通過(guò)測(cè)定與經(jīng)皮給藥有關(guān)的生理反應(yīng)或引起的其他體內(nèi)化學(xué)物質(zhì)濃度變化間接獲得。如胰島素的經(jīng)皮給藥系統(tǒng)可通過(guò)測(cè)定體內(nèi)血糖濃度變化，間接獲得胰島素在體內(nèi)的作用過(guò)程。

直接分析法包括HPLC法，氣相色譜（GC）法，氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）聯(lián)用法，液相色譜-質(zhì)譜（LC-MS）聯(lián)用法，放射性免疫（RIA）法等。CE法在透皮吸收樣品分析中有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，如與色譜手性分離柱相比，CE技術(shù)對(duì)生物樣品中手性藥品的分離顯得更為經(jīng)濟(jì)、方便。但另一方面還需要發(fā)展一系列更為有效、簡(jiǎn)便及耗樣量少的方法對(duì)生物樣品進(jìn)行前處理，解決基底干擾問(wèn)題。

劉繼勇等[6]在痹痛寧貼劑的制備及體外釋放、透皮吸收研究中，采用了高效毛細(xì)管電泳（HPCE）技術(shù)。使用美國(guó)惠普公司的HPCE毛細(xì)管電泳儀，二級(jí)管陣列檢測(cè)器，其中石英毛細(xì)管柱為50 μm×32 cm，運(yùn)行緩沖液為50 mmol/mL的pH為6.0的磷酸鹽緩沖液（含20%無(wú)水乙醇），壓力進(jìn)樣（2 kPa×5 s），分離電壓8 kV，檢測(cè)波長(zhǎng)200 nm，操作溫度30℃。每次進(jìn)樣前依次用0.1 mol/L NaOH沖洗柱1 min，二次蒸餾水沖洗1 min，緩沖液沖洗2 min，在此條件下分離良好。生物堿類(lèi)藥物的堿性強(qiáng)，極性大，采用HPLC分析時(shí)，往往色譜柱吸附太強(qiáng)，造成峰形不好，易拖尾。雖然改善流動(dòng)相介質(zhì)可取得一定效果，但常用的離子對(duì)試劑對(duì)色譜柱污染極大，且分析周期長(zhǎng)，不適合大量樣品的檢測(cè)。采用HPCE法測(cè)定制劑、體外釋放液及透皮擴(kuò)散液中東莨菪堿的含量，分離效果好，可不經(jīng)富集直接檢測(cè)，操作簡(jiǎn)便快速。

蔣孟良等[7]采用HPCE法測(cè)定傷痛外搽酊中毒性成分的透皮吸量。石英毛細(xì)管為內(nèi)徑50 μm，有效長(zhǎng)度50 cm，緩沖液為0.02 mol/L的磷酸鹽，pH為7.0，施加電壓為20 kV，溫度為25℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm，以外標(biāo)法計(jì)算含量。檢測(cè)靈敏度高，大鼠在體實(shí)驗(yàn)中的平均血藥濃度為（32.44 ±3.21）ng/mL。

5 展望

目前，國(guó)內(nèi)經(jīng)皮吸收藥物測(cè)定研究主要應(yīng)用HPLC，但其樣品預(yù)處理費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，平衡時(shí)間和分析時(shí)間較長(zhǎng)，且耗用大量流動(dòng)相。而CE具有高效、價(jià)廉等優(yōu)點(diǎn)。更適于普及和發(fā)展，通過(guò)對(duì)樣品進(jìn)行濃縮預(yù)處理，可提高檢測(cè)靈敏度。同時(shí)CE技術(shù)如何與其他方法和技術(shù)如HPLC、MS等聯(lián)合應(yīng)用，是今后的研究方向和課題。

[1]陳 義.毛細(xì)管電泳技術(shù)及應(yīng)用[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2000：5-7.

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[3]Lin CC，Li YT，Chen SH.Recent progress in pharmacokinetic applications of capillary electrophoresis[J].Electrophoresis，2003，24：4 106-4 115.

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[5]Wesrer RC，Mclcndres J.Percutaneous absorption of azone following single and multiple doses to human volunteers[J].Pharm Sci，1994，83（2）：124.

[6]劉繼勇，顧 清，胡晉紅，等.痹痛寧貼劑的制備及體外釋放、透皮吸收研究[J]. 中成藥，2004，26（6）：437-439.

[7]蔣孟良，董桂蘭，易延逵，等.傷痛外搽酊活血祛瘀作用的研究[J].中成藥，2000，22（11）：806-808.