玉米種子純度室內檢驗方法的研究現狀與應用展望

趙欣欣，于運國，崔克艷

（1.吉林農業大學農學院，吉林 長春 130118；2.吉林省遼源市龍山區工農鄉政府 ）

種子純度是影響作物產量的重要因素。研究發現，種子純度每下降1%，就使作物產量下降1%左右。如果種子純度不達標準，優良品種則無法發揮其高產潛力。玉米在雜交制種時，親本種子純度低、去雄操作不及時不徹底、其他父本花粉的雜交、種子收獲及加工帶來的機械混雜等多種因素都會導致種子純度下降。做好玉米種子純度的檢驗工作是控制假劣種子流入市場的重要措施。每年我國玉米新品種都大量涌現，玉米遺傳資源較狹窄又致使很多品種遺傳基礎較為相似，這些因素都給品種純度的檢驗工作帶來新困難和新挑戰。玉米種子純度的室內檢驗是及時、快速測定種子純度的有效方法，其中包含的各種方法各具特點，成為眾多專業人士不斷探索和研究的熱點內容，尤其是現代檢測手段的出現，為種子純度檢驗帶來了生機，也意味著現代種子純度檢驗技術必將取代傳統落后方法而開創種子純度檢驗的新時代。

1 籽粒和幼苗形態特征鑒別

籽粒和幼苗形態特征鑒別是分別根據玉米種子籽粒的外部形態（如粒型、粒色、粒頂部形狀及顏色及粉質多少、胚大小及形狀、稃色等）和幼苗的芽鞘色的外觀性狀進行鑒別。這種方法雖然簡單、直觀，但是生產上推廣的品種種類繁多，且雜交種多數與其母本自交系籽粒相同或相近，這些因素決定這種方法不適應當前的純度檢驗需求。

2 以生化指紋為依據的電泳鑒別法

種子中的蛋白質是基因表達的產物，不同品種的遺傳差異性則表現在它們所含有的蛋白質種類及分子量大小，因此，通過凝膠電泳技術可以將不同品種的貯藏蛋白或同工酶組分的差異性表現出來，從而對種子純度進行測定。目前，在我國以生化指紋為依據的電泳鑒別法被種子公司所廣泛采用[1]。

2.1 貯藏蛋白電泳鑒別法

目前，應用和研究最廣泛的是玉米種子純度鹽溶蛋白聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定方法，這項技術在2001年已被列入我國農業行業標準（NY/T449-2001），并在2001年11月11日實施[2]。該方法因簡單、經濟、準確、快速的特點，被種業界廣泛接受。很多研究者[3～6]對該項技術的操作技術及技巧進行了大量的探索和研究。方玉春等[7]應用該法分別對玉米雜交種和親本自交系進行純度檢測，鑒定率為89%，同時還能有效區別單交種及其親本。令人擔憂的是，這種方法在盡顯優勢的同時也表現出一定的局限性，即對親本為姊妹系、多環系、改良系等遺傳基礎較為復雜的雜交種、特殊單交種(親本與雜交種譜帶極相似)及正反交種卻無法有效、準確鑒別[8]?？梢?，種子純度室內檢驗需要新的更加有效的方法取而代之。

2.2 酯酶同工酶電泳鑒別法

酯酶同工酶聚丙烯酰胺電泳技術被研究者進行一定研究[12，13]，發現測定玉米種子純度結果穩定，譜帶清晰，特異性強，但由于酶的提取要求嚴格，且具有組織和器官特異性等特點，導致這種方法很難在生產上廣泛推廣和采用。

3 DNA分子標記鑒別

品種的差異性實質是品種間基因型的差別。DNA分子標記技術是通過直接分析DNA的多態性來診斷生物內在基因的排布規律及其外在性狀的表現規律，通過鑒定DNA水平上的差異來鑒別品種。DNA指紋圖譜技術的應用使品種純度的檢驗由傳統技術達到分子水平，為品種純度鑒定提供了準確、可靠、快速、方便的方法。利用DNA分子標記技術進行種子純度鑒定有以下特點：（1）DNA分子標記數量大，多態性水平高，可鑒定表型和電泳方法難以鑒別的品種；（2）不受時間和空間影響，即可在生長發育的任何階段取材鑒定；（3）分離出的樣品DNA可長期保存，這對于進行追溯性或仲裁性鑒定非常有利。

DNA分子標記技術有三類，以雜交為基礎的分子標 記 （RFLP：Restriction Fragment Length Polymorphism，限制性片斷長度多態性)；以PCR反應為核心的DNA指紋技術 （RAPD：Randomly Amplified Polymorphic DNA，隨機擴增多態性 DNA、AFLP標記：Amplified Fragment Length Polymorphism，擴增片段長度多態性、SSR標記：Simple Sequence Repeats或 micro satellite DNA， 微 衛 星 DNA、SCAR：Sequence– related Amplified Polymorphism,序列相關擴增多態性等）；以測序為核心的新型的分子標記（SNP：Single—nucleotide polymorphism，單核苷酸多態性等）。這三類標記對于種子純度鑒定并非都適用，比如以雜交為基礎的分子標記因成本過高，操作極其繁瑣、復雜，很難在種子公司普及和推廣；而另外兩類標記則表現出較強的可行性。

3.1 以PCR反應為核心的DNA指紋技術

3.1.1 RAPD標記技術：RAPD技術操作簡單、方便，只需PCR擴增和瓊脂糖凝膠電泳，多態性高，成本較低，多位研究者[14～16]將其應用于玉米種子純度的鑒定研究并證明了其可行性。盡管RAPD具有穩定性和重演性差的缺點，但是顏廷進[14]認為，只要每一次反應條件嚴格控制，就可以得到理想的重復結果。另外，林清也指出只要RAPD反應具備以下條件，就能獲得理想的純度鑒定結果：①高質量的DNA；②穩定的PCR反應條件；③穩定的程序；④適宜的引物；⑤設置重復。

3.1.2 AFLP標記技術：AFLP技術是限制性酶切、PCR和聚丙烯酰胺電泳相結合的一項技術，具有結果準確、可靠且重演性好，DNA多態性高的優點，同時克服了RFLP多態性檢出率低的缺點及RAPD技術對實驗條件很敏感、實驗結果的重復性和可靠性較差的缺點。這種方法在玉米種質資源鑒定和類群劃分上得到廣泛研究[17，18]，但其缺點是操作技術較為繁瑣，并要求操作者具有一定的操作技能，而且成本較高（AFLP技術是一種專利技術，受專利保護），當前使其在種子純度的快速檢測普及應用仍存在一段距離。但是，如果該方法能簡化并降低成本，將成為極有推廣前途的一項種子純度檢測的實用技術。

3.1.3 SSR標記技術：動、植物基因組中分布著許多由1～4個堿基對組成的簡單重復序列，每個座位上重復單位的數目及重復單位序列的差異產生多態性,這種多態性遠多于 RFLP的多態性，是一種較為理想的DNA標記技術，在玉米品種鑒定上進行了廣泛的研究[20，21]。 吳明生[22]通過 SSR分子標記技術檢測了 24份雜交玉米種子的純度，同時將鑒定結果與田間種植鑒定結果進行比較，證實兩種方法檢測結果具有一致性，SSR分子標記可以替代田間種植方法進行玉米純度鑒定。由于該標記技術具有共顯性、多態性豐富、重復性強、操作簡便、快速的特點，非常適于在種子公司及管理部門推廣應用，因此，當前被認為是用于玉米品種純度鑒定的最可靠且實用的分子標記技術。

3.1.4 SRAP標記技術：SRAP是在總結已有的DNA分子標記的優缺點的基礎上開發的一種新型標記技術。SRAP利用引物對ORF（開放性閱讀框）進行擴增，因個體不同以及物種的內含子、啟動子與間隔長度不等而產生多態性。這種標記技術因引物具有設計簡單、結果穩定、操作簡單的優點。SRAP不需要像SSR標記那樣花費人力物力進行引物開發，比RAPD標記穩定；不需要像AFLP那樣需要預擴增和連接，但擴增結果的多態性很豐富。SRAP標記被用于玉米自交系遺傳多樣性的的劃分[23，24]，但在玉米種子純度的鑒定中未見報道，由于其強大的優點在玉米種子純度的鑒定研究將具有廣泛的研究前景。

3.2 以測序為核心的新型的分子標記

SNP是指群體中基因組 DNA序列上單個核苷酸的變異。目前，基于SNP的分子標記已在人類和動物的疾病等方面進行大量研究，在植物中擬南芥、水稻[25，26]也有相關研究報道。隨著玉米基因組測序的全面開展，以序列為基礎SNP標記展現了巨大的利用潛力。

通過以上介紹不難看出，各種純度測定方法各具優缺點，在實際種子純度檢測過程中應根據具體情況加以選擇利用。籽粒形態鑒別法雖然較為粗糙，主觀性較強，但當種子公司急于調種或村屯收種時，現場不具備檢驗設備，檢驗員可以憑借豐富的種子識別經驗，作為臨時方法用以鑒別種子的真實性，但之后必須采用可靠方法再進行純度測定；但對于新育成的品種，檢驗員不能熟練掌握其外部特征時或對那些較難識別的品種，此種方法應慎用。

對種子純度可靠、簡便、經濟、高效地進行檢測一直是人們關心和追求的焦點。目前，我國大中型種子公司測定玉米種子純度時都是以鹽溶蛋白聚丙烯酰胺電泳鑒定方法為主。這種方法對少數親本及其雜交種的區分以及遺傳基礎復雜的材料尚不能檢驗和鑒別，可考慮采用分子標記進行鑒別。因此，方法的選擇應以簡單、準確、經濟為前提，盡管分子標記技術比生化指紋鑒別更加準確、可靠，但是相對來講測定成本較高，因此在實際工作中可作為生化指紋鑒別的補充方法。況且，目前我國中小型種子公司并不具備分子標記測定的設備和條件，所以這項技術在推廣和使用上仍然受到限制。但從我國育種工作的發展現狀來看，隨著科技不斷進步，新技術必然替代傳統技術，分子標記方法將逐漸成為蛋白質或同工酶電泳鑒定的替代方法。

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