碳酸羥基磷灰石的生物礦化研究

朱慶霞 徐瓊瓊 羅民華

(景德鎮陶瓷學院，景德鎮：333001)

1 引言

人體自然骨中磷灰石礦物主要是非化學計量的磷灰石晶體，碳酸根是骨磷灰石中含量最多的摻雜離子。碳酸根能替代羥基磷灰石（HA）晶格中的羥基或磷酸根，分別形成A型或B型替代，或同時占據兩個位置，形成AB型替代的碳酸羥基磷灰石（CHA）[1]。在人體骨中的CHA以B型替代為主，A型和B型替代的摩爾比大約為0.7～0.9[2]。對骨科材料在體外生理模擬環境中的生物活性的檢測和表征是評價材料性能的一個重要指標。骨生物活性材料在生理環境中可發生一系列離子交換和溶解-沉淀反應,形成生物礦化的碳酸羥基磷灰石（hydroxy-carbonate-apatite, HCA）晶體。HCA在組成和結構上與天然骨的無機礦物類似,可吸附多糖、膠原等細胞外基質,并與宿主骨組織發生骨性結合,促進新骨的形成和生長[3]。多種無機、有機和金屬材料都進行過仿生礦化研究[4-6]，然而對本身含有碳酸根的CHA材料在生理溶液中的仿生礦化卻研究得很少。因此本文將化學組成類骨的CHA和HA浸泡在生理溶液中進行仿生礦化，研究了碳酸根替代對仿生礦化性能的影響，進而對CHA材料的生物活性進行評估。

2 實驗

2.1 粉體的制備

HA和CHA粉體的制備：以硝酸鈣(Ca(NO3)2· 4H2O)、磷酸氫二銨((NH4)2HPO4)為原料，控制Ca(NO3)2·4H2O與(NH4)2HPO4的摩爾比為1.67，以適當的速度將(NH4)2HPO4溶液滴加到Ca(NO3)2·4H2O溶液中制備HA。以Ca(NO3)2·4H2O、(NH4)2HPO4和NaHCO3為原料，控制Ca(NO3)2·4H2O，(NH4)2HPO4和NaHCO3的摩爾比,以適當的速度將 (NH4)2HPO4和NaHCO3的混合溶液滴加到Ca(NO3)2·4H2O溶液中制備CHA。在整個反應過程中，通過滴加氨水調節溶液的pH值在10～11之間，反應溫度為90℃。反應結束后，繼續攪拌3 h，然后在室溫下陳化24 h，再用蒸餾水洗滌、離心、過濾、120℃干燥。

2.2 樣品的制備

將CHA和HA粉體在250 MPa等靜壓作用下壓成塊體，將CHA塊體置于自制的通有濕二氧化碳氣體（其中濕氣的帶入是將氣體在進入石英管式爐前，流經室溫下盛有蒸餾水的三口瓶而實現的）的石英管式爐內進行熱處理。作為對比，將HA塊體在空氣氣氛中加熱處理。控制兩組樣品經Archimedes法測試的致密度均為91%，其中CHA樣品經FTIR和元素分析，碳酸根含量為5.72wt%,A型和B型替代的摩爾比為0.72。兩組樣品均經過No.1000防水砂紙拋光處理，然后在雙蒸餾水中超聲清洗。

表1 人體血漿和模擬生理溶液（S B F）的各種無機離子濃度（10-3mo l/L）Tab.1 Ion concentration of human plasma and SBF solution(10-3mol/L)

圖1 C H A在S B F溶液中反應不同時間的S E M形貌Fig.1 SEM morphologies of CHA reacted with SBF for different times(a)6 days;(b)12 days;(c)24 days

2.3 模擬體液的配制

配制SBF溶液所使用的化學藥品均為分析純化學試劑。溶液在37℃水浴恒溫條件下進行配制，各藥品在磁力攪拌下按順序緩慢加入去離子水中，溶液始終為清澈透明狀態。一旦出現輕度乳濁，則說明有沉淀物形成，溶液則不能再用。最終溶液用HEPES(N-(2-羥乙基)－對二氮己環N'-(4-丁烷磺酸))調整到pH=7.4，密封于玻璃容器中并置于冰箱內冷藏保存。模擬生理溶液的組成如表1所示。作為對照，表中同時列出了人血漿中的各種無機離子濃度。

2.4 樣品性能的表征

用 X射線衍射（X-ray diffraction,XRD)儀(PANalytical X'pert PRO,Netherlands)慢速掃描確定物相，工作條件為管壓40 kV，管流40 mA，2θ的步長為0.02°，實驗結果與JCPDS卡片對照分析。用Fourier變換紅外（Fourier transform infrared,FTIR）光譜儀(Vector 33,Germany)分析樣品的分子基團，特別是碳酸根的振動。用躺滴法（A sessile drop method）接觸角測定儀(OCA15，dataphysics,Germany)測量實驗液體在樣品表面的接觸角以計算表面能。采用LECO1530VP型掃描電子顯微鏡進行表面形貌觀察，并用日本日立公司生產的Z-5000型原子吸收光譜儀分析了SBF溶液與材料反應不同時間后，鈣離子濃度的變化。

圖2 H A在S B F溶液中反應不同時間的S E M形貌Fig.2 SEM morphologies of HA reacted with SBF for different times(a)12 days;(b)18 days;(c)24 days

3 結果與討論

對CHA和HA兩組樣品進行仿生礦化，每組平行試樣不少于5個。分別將各組樣品浸入盛有SBF的密閉聚乙烯瓶中，其中SBF溶液的體積按試樣表面積與溶液的體積比為0.1cm-1標準量取。保持37.0℃恒溫，對不同反應時間的SBF溶液分別取樣，置于冰箱中冷藏保存，用于溶液中離子濃度的分析。每組試樣于不同反應時間后取出，用去離子水沖洗，室溫80℃烘箱干燥，用于礦化涂層的成分分析和形貌分析。

3.1 礦化層表面形貌分析

在SBF中浸泡不同的時間，取出后進行SEM觀察，圖1和圖2分別為CHA和HA經不同礦化時間的樣品表面形貌。

CHA礦化6天后，可見低結晶度的HCA晶核沉析在樣品表面，大小約為30～40nm，在表面的分布較為均勻（圖1a）；反應12天后，材料表層被長度約為150～200nm的葉片狀HCA微晶層所覆蓋（圖1b），隨著反應時間的延長，HCA層繼續生長，反應24天形成HCA球形晶簇，其直徑在200～300nm，球形晶簇相互融合，形成板狀HCA覆蓋層（圖1(c)）。

圖3 樣品動態接觸角Fig.3 Dynamic contact angles between(a)CHA and propane trio;(b)HA and propane trio;(c)CHA and SBF;(d)HA and SBF

由圖2所示，HA樣品的礦化過程與CHA類似，但是礦化層在HA樣品上的沉積速度要低于CHA樣品。

在SBF溶液中生物活性材料表面形成HCA晶核是非均勻成核過程[7-8]，CHA中由于碳酸根的替代，致使晶體結構畸變，溶解度增加[9-10]，CHA樣品表面Ca2+、PO43-離子的溶出量大于HA樣品表面的溶出量，一方面使得溶液中Ca2+、PO43-濃度增大，過飽和度增加，而成核速率對過飽和度的變化非常敏感，因此，表面微區內Ca2+、PO43-離子過飽和度的增加必將提高樣品表面晶核的形成速率；另一方面材料表面鈣磷化合物的溶出，使得表面缺陷增多，增加了表面成核位點，也有利于增加晶核的形成量。

同時，表面能的影響不可忽視，表面能越大，在形成礦化層的過程中，吸附和反應更容易在高能表面上發生。圖3分別為生理溶液和丙三醇在樣品CHA和HA表面形成的動態接觸角。根據接觸角的測試數據，表面能采用Owens-Wendt-Kaeble's方程[11]計算求得CHA的表面能為50±2mJ/m2，而HA的表面能為43±2 mJ/m2。固體表面的暴露基團和固體表面粗糙度等對接觸角有明顯的影響[12]。CHA和HA在測試前經過相同的樣品制備過程，其表面粗糙度和致密度基本一致，故主要是碳酸根的替代導致樣品表面組分發生變化，從而進一步影響表面能。S.A.Redey[13-14]等人發現A型替代CHA的表面能低于HA的表面能，從而導致破骨細胞在其表面吸附量較少，膠原的生成量也較少。而本實驗中CHA的替代類型是以B型為主，這種類型的替代導致了表面能升高，磷灰石晶體在其表面形核時接觸角小，所需克服的形成能就較小，核化速率大，形成礦化層的時間短，這與SEM結果吻合。

圖4 S B F浸泡液中C a2+濃度隨浸泡時間的變化曲線Fig.4 The change of Ca2+concentration in SBF solution with reacting times

當樣品在模擬體液中浸泡時,Ca2+的溶解與消耗使得樣品表面與模擬體液間形成Ca2+的濃度梯度層。圖4所示為模擬體液中Ca2+濃度隨浸泡時間變化的曲線圖。在浸泡的最初階段，由于樣品表面Ca2+的溶解速度大于其沉積速度，因此濃度梯度層中靠近樣品表面部分的Ca2+濃度大于靠近模擬體液部分的Ca2+濃度,Ca2+逐漸由樣品表面向模擬體液中擴散。Ca2+濃度明顯上升。CHA樣品浸泡6天后，溶液中Ca2+濃度達到最大值，約132ppm，而HA樣品溶解速度較慢，并且溶解度較低，在浸泡12天后，溶液中Ca2+濃度才達到最大值，約117ppm。此后由于HCA在樣品表面析出，消耗了溶液中的Ca2+，溶液中Ca2+濃度逐漸減少，并趨于穩定。

3.2 礦化層的分析

通過衰減全反射紅外光譜對浸泡后的試樣表面進行測試。圖5為HA樣品在SBF浸泡不同時間后的FTIR譜圖。所有樣品都出現羥基的擺動振動峰(630cm-1,ν2)、磷酸根的非對稱伸縮振動峰 (1090～1044cm-1，ν3)和對稱伸縮振動峰（960cm-1，ν1）。浸泡前和浸泡6天后的樣品表面并沒有明顯的碳酸根的振動峰，表明在這個過程中并沒有形成具有HCA結構的礦化層。當浸泡12天后，譜圖中開始出現CO32-非對稱伸縮振動吸收帶（1400～1500 cm-1，ν3）和彎曲振動吸收峰（870～880cm-1，ν2），并且ν3分裂成雙峰，這是HA中CO32-基團的特殊振動模式[15]。表明隨著浸泡時間的延長，通過HA樣品表面的溶解，SBF溶液的過飽和度逐漸增加，形成的磷灰石晶核便會通過消耗溶液中的Ca2+、PO43-、CO32-等離子自發長大，從而形成在組成和結構上都與骨組織類似的HCA礦化層。

圖5 H A樣品在S B F溶液中反應不同時間的F T I R譜圖Fig.5 FTIR spectra of HA sample reacted with SBF for different times(a)before soaking;(b)6 days;(c)12 days;(d)24 days

圖6為CHA樣品在SBF浸泡不同時間后的FTIR譜圖。它同樣具有典型的磷灰石類礦物紅外光譜的特點。但與HA樣品組不同的是，CHA樣品組碳酸根的振動峰較強，碳酸根含量較高。這是由于CHA含有較高的碳酸根含量，溶解度高，能溶解較多的碳酸根到SBF溶液中，故在形成礦化層時，可以有更多的碳酸根摻雜到磷灰石結構中。紅外光譜中特征吸收帶的寬窄、尖銳程度以及是否發生間并分裂，可以反映礦物的結晶程度[16]。在圖6a中可以看出CHA樣品中ν3-CO3尖銳的雙峰和明顯的ν3-PO4和ν1-PO4峰。在圖6 (b),(c)中，CO32-的ν3振動吸收帶加寬，以致兩峰相連而合并，并且1088 cm-1處和960cm-1處PO43-峰消失，只在1100～900 cm-1處出現一個寬而鈍的彌散峰，表明此時形成的礦化層結晶度比較低。但當浸泡時間延長為24天，ν3-CO3重又發生分裂，ν1-PO4變得比較清晰，出現了較弱的1088cm-1處PO43-峰，吸收峰發生分裂且峰形尖銳，說明在反應的后期，礦化層由無定形態向晶態過渡，結晶程度不斷提高。

3.3 礦化層的分析

圖7 樣品表面礦化層的X R D譜圖Fig.7 XRD spectra of the samples with mineralized layers

圖7給出了HA和CHA樣品在SBF中礦化12天后表面XRD譜圖。兩種樣品礦化層的主晶相均為HA。Xiong[17]等經過計算，認為在pH=7.4的生理溶液環境中，磷酸八鈣（OCP）的成核速率是大于CHA和HA的，故沉積層晶相往往是由OCP和HA組成的。由于OCP和HA的衍射峰在高角度處大部分互相重合而不易區別，故進行了樣品的小角衍射，但在譜圖中并未出現位于2θ=4.72°處的OCP（010）晶面的特征衍射峰。這是由于在生理條件下，OCP是熱力學亞穩相，浸泡12天后，OCP已經完全轉化為熱力學穩定的HA相，無其他晶相存在。

4 結論

利用體外仿生礦化的方法評估了碳酸羥基磷灰石的生物活性。研究結果表明：

（1）碳酸羥基磷灰石樣品在模擬生理溶液中可形成表面類似天然骨中礦物的碳酸羥基磷灰石層（HCA）。

（2）B型替代為主的CHA樣品礦化6天后，可見低結晶度的HCA晶核沉析在樣品表面；隨著浸泡時間的延長，生成的晶體是葉片狀HCA，最后形成相互融合的球形晶簇，覆蓋于整個樣品表面。

（3）B型替代為主的CHA材料較高的溶解度和表面能導致礦化層形成速度較快，與HA樣品相比，CHA礦化能力較好，具有較高的生物活性。

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