NF-κB信號途徑在小鼠狼瘡性腎炎發病中的可能作用①

封曉娟 劉淑霞 張玉軍 郭惠芳 郝 軍 陳 寧 唐麗娟 劉青娟 吳海江

（河北醫科大學病理教研室,石家莊 050017）

NF-κB信號途徑在小鼠狼瘡性腎炎發病中的可能作用①

封曉娟 劉淑霞 張玉軍 郭惠芳 郝 軍 陳 寧 唐麗娟 劉青娟 吳海江

（河北醫科大學病理教研室,石家莊 050017）

目的:探討NF-κB信號途徑在小鼠狼瘡性腎炎發病中的可能作用。方法:選取16周齡的雄性BXSB小鼠（狼瘡性腎炎模型組）和同周齡C57BL/6小鼠（正常對照組）作為研究對象,透射電鏡和PAS染色觀察腎組織的超微結構形態改變;RT-PCR技術檢測小鼠全血中HMGB1mRNA的表達變化。采用ELISA方法檢測血清中HMGB1蛋白濃度;免疫組織化學檢測腎組織中HMGB1和PCNA蛋白的表達變化;Western blot和流式細胞術檢測腎組織中RAGE、p-NF-κB和IκB蛋白的表達。結果:16周時,與正常的C57BL/6小鼠相比,BXSB小鼠血清中BUN水平及尿中微球白蛋白水平明顯升高;與正常的C57BL/6小鼠相比,BXSB小鼠全血中HMGB1mRNA水平和血清中HMGB1蛋白濃度明顯升高;16周時,與正常的C57BL/6小鼠相比,BXSB基底膜明顯增厚,部分足突融合,內皮細胞下可見團塊狀電子致密物沉積;與正常的C57BL/6小鼠相比,BXSB小鼠腎組織的腎小球中可見較多的PCNA陽性表達,腎小管上皮細胞核內也可見少量的表達;BXSB小鼠腎組織中HMGB1蛋白表達升高,HMGB1蛋白尤其在細胞增生明顯而肥大的腎小球呈高表達,主要位于細胞漿和細胞外;而在C57BL/6小鼠腎臟組織中以小管細胞核表達為主;與對照組相比,BXSB小鼠腎組織p-NF-κB和RAGE蛋白表達明顯升高;而IκB蛋白表達明顯降低;HMGB1蛋白與p-NF-κB蛋白表達呈顯著正相關（r=0.833,P=0.000）;p-NF-κB蛋白與 RAGE蛋白表達呈顯著正相關（r=0.621,P=0.018）;HMGB1蛋白與 RAGE蛋白表達呈顯著正相關（r=0.848,P=0.000）;p-NF-κB蛋白與 IκB蛋白表達呈顯著負相關（r=-0.759,P=0.002）。結論:HMGB1在小鼠狼瘡性腎炎中的致炎作用可能部分通過結合其受體RAGE,激活NF-κB信號途徑,促進腎小球固有細胞的增生,從而導致增生性腎小球腎炎形成而實現的。

狼瘡性腎炎;HMGB1;RAGE;NF-κB;IκB;細胞增殖

系統性紅斑狼瘡（Systemic lupus erythematosus,SLE）是一種侵犯多系統的自身免疫性疾病,常伴腎臟受累即狼瘡性腎炎（Lupusnephritis,LN）。其病理變化主要為系膜細胞增生和系膜基質增多,并伴有明顯的淋巴細胞和巨噬細胞的浸潤。目前研究證實,細胞因子在SLE的發病和病變進展過程中發揮著重要的作用。高遷移率族蛋白1（High mobility group protein box 1,HMGB1）是最新發現的一種新型炎性細胞因子,參與細胞核內多種生物學功能。研究發現,HMGB1是狼瘡性腎炎發病過程的重要的細胞因子之一,且與患者蛋白尿的形成有關,TLR4（Toll like receptor 4,TLR4）是其受體之一,但并非是主要的受體[1],同時其作用的信號轉導機制尚不清楚。因此為了探討其在狼瘡性腎炎發病過程中的信號機制,本研究以 BXSB小鼠為研究對象,觀察HMGB1在其腎組織中的表達變化,并通過檢測PCNA、p-NF-κB、IκB 和晚期糖基化終產物受體（Receptor for advanced glycation end products,RAGE）的表達變化,分析其與HMGB1的相關性,闡明NF-κB信號轉導機制在狼瘡性腎炎發病中的可能作用,為臨床對狼瘡性腎炎的防治提供實驗理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 兔抗小鼠Phospho-NF-κB p65（Ser276）多克隆抗體（Cell signaling）;兔抗鼠HMGB1多克隆抗體（abcom）;兔抗鼠RAGE（Bioreagent）、PCNA 單克隆抗體（Santa Cruz）;IκB（eBioscience）,β-actin（北京中杉金橋公司）,HRP標記的IgG二抗（北京中杉金橋公司）,免疫組織化學試劑盒（晶美生物工程有限公司）,NF-κB原位雜交試劑盒（Santa Cruz）;Epics-XLⅡ型流式細胞儀（美國Beckman Coulter）;化學發光法西門子全自動免疫化學發光分析儀;RNAprep pure血液總RNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司）;HMGB1 ELISA試劑盒（Unionhoest公司）。

1.2 實驗動物及分組 11周齡雄性BXSB小鼠16只,體重18～22克,引種自美國Jackson實驗室,由北京大學醫學部免疫學系繁殖飼養;另取11周齡雄性C57BL/6小鼠14只,體重18～22克,購自北京大學醫學部動物中心。所有動物于清潔環境中飼以標準飼料,動物自由進食、飲水。周齡雄性BXSB小鼠為狼瘡性腎炎模型組（LN組）,同周齡雄性C57BL/6小鼠為正常對照組,所有動物適應性飼養一周后進入實驗,實驗起點為12周齡初、實驗終點為16周齡末,共四周。

1.3 標本采集 所有小鼠均于實驗終點眼眶取血,處死動物。腎臟皮質分別于4%多聚甲醛、2.5%戊二醛固定,另留取于液氮速凍后轉至-153℃冰箱待用。

1.4 血清BUN、Ccr水平及尿微量白蛋白的測定膀胱穿刺取尿,化學發光法西門子全自動免疫化學發光分析儀檢測尿微量球蛋白;內眥靜脈取血,室溫靜止2小時,離心后取上清,用希森美康CHEMIX-180全自動生化測定儀測定BUN和Ccr水平。

1.5 ELISA方法檢測血清中HMGB1的濃度 檢測過程嚴格按照試劑盒說明書操作。采用常規雙抗體夾心ELISA法檢測,TMB顯色,在450 nm處測定吸光度（A）值。通過繪制標準曲線求出標本中HMGB1的濃度。

1.6 RT-PCR技術檢測小鼠全血中HMGB1mRNA的表達變化 內眥靜脈取血,采用RNAprep pure血液總RNA提取試劑盒提取新鮮血液樣品總RNA,在25 μl總體積中以O ligo（dT）15引物將2μg總反轉錄成cDNA,經PCR擴增合成內參18SrRNA和目的DNA。反應條件為:95℃預變性5分鐘,94℃變性1分鐘,不同退火溫度退火時間60秒,72℃延伸60秒,循環35次,72℃再延伸8分鐘（PCR引物序列及PCR反應條件詳見表1）。取5μl PCR產物,經1%瓊脂糖凝膠上電泳。用凝膠成像系統攝像后并讀取其積分吸光度值。根據PCR產物電泳條帶與內參照18S rRNA相對強度的比值來確定mRNA的相對表達水平。

1.7 常規光鏡檢查 腎組織經4%多聚甲醛固定后,常規脫水、包埋,切片厚2μm,分別行HE和PAS染色。

1.8 電鏡觀察腎組織形態學變化 腎皮質組織2.5%的戊二醛4℃固定4小時,繼以2%鋨酸固定2小時,然后用梯度丙酮脫水,Epon812浸透與包埋,超薄切片機進行切片,醋酸鈾及檸檬酸鉛電子染色,H-7500透射電鏡觀察、照相。

1.9 免疫組織化學檢測腎組織中HMGB1及PCNA的表達變化 切片厚4μm,常規脫蠟水化,一抗為兔抗鼠PCNA單克隆抗體（1∶50稀釋）、兔抗鼠HMGB1多克隆抗體（1∶200）,二抗為生物素化羊抗兔IgG（1∶100稀釋）,以PBS代替一抗作為陰性對照,DAB顯色,光鏡觀察陽性信號。結果判定:HMGB1陽性信號定位于細胞核、細胞漿或細胞外,為棕黃色顆粒;PCNA陽性信號均定位于細胞核呈棕黃色顆粒。

表1 PCR引物序列及PCR反應條件Tab.1 PCR p rimer

1.10 FCM 檢測腎組織中HMGB1、RAGE、p-NF-κB和IκB蛋白的表達變化 將標本用網搓法制成單細胞懸液,采用間接免疫熒光標記方法,取單細胞懸液1×106ml-1,加入兔抗鼠HMGB1、RAGE、p-NF-κB 和IκB多克隆抗體0.1ml,室溫孵育30分鐘,PBS洗滌后加入1∶50羊抗兔FITC-IgG二抗工作液100μl,避光室溫孵育30分鐘,PBS洗滌后,在Epics-XLⅡ型流式細胞儀進行檢測。數據和組方圖輸入計算機,應用Expo32 ADC軟件進行免疫熒光資料分析。設PBS代替一抗和二抗的陰性對照,以及只加一抗或二抗的陽性對照和同型對照。以熒光指數（FI）表示HMGB1、p-NF-κB、RAGE 和 IκB 的相對含量,公式 :

FI=（樣品蛋白表達的平均熒光強度 -對照樣品平均熒光強度）/正常對照樣品平均熒光強度。

1.11 Western blot檢測腎組織中RAGE的表達變化取100mg腎組織,碾碎后加入1m l細胞裂解液超聲粉碎,4℃15 000 r/m in離心15分鐘,上清用考馬斯亮藍法進行蛋白質定量。相同量的蛋白經SDSPAGE凝膠電泳,轉膜,5%脫脂奶粉37℃封閉2小時后,加入兔抗小鼠 RAGE抗體（1∶200）、actin多克隆抗體（1∶1 000）,4℃過夜。TBST漂洗后滴加HRP標記的IgG二抗（1∶5 000）雜交,洗膜后ECL化學發光并曝光成像,利用圖像分析系統掃描。β-actin作為內參照,結果用靶蛋白/β-actin的相對吸光度值表示。

2 結果

2.1 兩組小鼠腎功能比較 16周時,BXSB小鼠血清中BUN水平為（9.60±0.83）,尿微球蛋白水平為

（3.94±0.39）,明顯高于正常對照組（6.95±0.96;2.50±0.05）（P＜0.01,P＜0.01）;而CCr水平相比兩者無顯著性差異P＞0.05,表2。

2.2 不同組血清中HMGB1蛋白水平的表達變化

ELISA檢測結果顯示,狼瘡性腎炎模型組小鼠血清HMGB1蛋白（0.570 4±0.025 6）明顯高于正常對照組（0.536 5±0.001 5）（表2,P=0）。

2.3 不同組小鼠全血中HMGB1mRNA的表達 RTPCR產物經瓊脂糖凝膠電泳結果顯示,正常小鼠全血中幾乎檢測不到HMGB1mRNA的表達,而BXBS小鼠血中HMGB1mRNA相對表達量為（0.367 4±0.130 5）,明顯高于正常對照組（圖1,P＜0.05）。

2.4 兩組小鼠腎組織形態學改變 16周時,與正常對照組相比,狼瘡性腎炎模型組小鼠腎小球基底膜明顯不規則增厚,部分足突融合,內皮細胞下可見團塊狀電子致密物沉積（圖2和圖3）。

2.5 HMGB1蛋白在不同組小鼠腎組織的表達變化

圖1 HMGB1 mRNA在正常對照和狼瘡性腎炎模型組全血中的表達變化Fig.1 Expression of HMGB1mRNA in blood of control and LN group by RT-PCR

表2 不同組腎功能比較Tab.2 Rena l function change of different groups

免疫組織化學結果顯示,HMGB1蛋白陽性信號定位于細胞核、細胞漿或細胞外。在正常對照組小鼠腎組織中可見HMGB1少量表達,主要定位于腎小管上皮細胞胞核,腎小球表達甚少,而在狼瘡性腎炎模型組小鼠腎組織中HMGB1表達升高,腎小球和腎小管內均有表達,且主要定位于細胞漿和細胞外,尤其在細胞增生明顯的腎小球中呈強陽性表達（圖4）。

流式細胞術檢測結果顯示,與正常對照組小鼠相比,狼瘡性腎炎模型組小鼠腎皮質中HMGB1蛋白表達升高,經統計學處理有顯著性差異（P＜0.01,表3）。

2.6 不同組腎組織中PCNA的表達變化 免疫組織化學結果顯示,PCNA陽性信號主要定位于細胞核;正常對照組小鼠腎組織中未見PCNA陽性表達,而狼瘡性腎炎模型組小鼠腎組織的腎小球中可見較多的陽性表達,腎小管上皮細胞核內也可見少量的表達（圖5）。

圖2 PAS染色觀察不同組別腎組織的形態學變化（×400）Fig.2 PASstains of renal tissue in LN group（16 weeks）andcontrol group（×400）

圖3 透射電鏡觀察不同組腎小球基底膜的變化（20 000×）Fig.3 Transm ission electron m icroscope for change of basementmembrane in control and LN group（20 000×）

2.7 p-NF-κB 、IκB 和 RAGE 在不同組腎組織中的表達變化 流式細胞術檢測結果顯示,與正常對照組相比,狼瘡性腎炎模型組小鼠腎皮質中RAGE和 p-NFκB蛋白表達均升高,而IκB蛋白表達降低,經統計學處理有顯著性差異（P＜0.05或0.01,表3）。Western b lot結果顯示,狼瘡性腎炎模型組小鼠腎組織中RAGE相對吸光度值為22.49±12.71,明顯高于正常對照組（2.69±0.64）見圖6,P＜0.01。

圖4 免疫組織化學檢測正常對照和狼瘡性腎炎模型組腎組織中HMGB1蛋白的表達變化（IHC,400×）Fig.4 Expression of HMGB1 in renal tissue of control and LN group（IHC,400×）

圖5 PCNA在正常對照和狼瘡性腎炎模型組腎組織中的表達變化（IHC,400×）Fig.5 Expression of PCNA in renal tissue of control and LN group（IHC,400×）

表3 流式細胞術檢測正常對照組和狼瘡性腎炎模型組腎組織中HMGB1、RAGE、NF-κB和IκB蛋白的表達變化（±s）Tab.3 Expression of HMGB1,RAGE,NF-κB and IκB in renal tissue of controland LN group by FCM（±s）

表3 流式細胞術檢測正常對照組和狼瘡性腎炎模型組腎組織中HMGB1、RAGE、NF-κB和IκB蛋白的表達變化（±s）Tab.3 Expression of HMGB1,RAGE,NF-κB and IκB in renal tissue of controland LN group by FCM（±s）

Note:t-test,1）P＜0.05,2）P＜0.01 vs control.

Groups n HMGB1 p-NF-κB RAGE IκB Control group 7 1.00±0.04 1.00±0.13 1.00±0.06 1.00±0.05 LN group 7 1.28±0.072） 1.21±0.151） 1.25±0.042） 0.78±0.042）

圖6 RAGE在正常對照和狼瘡性腎炎模型組腎組織中的表達變化Fig.6 Expression of RAGE in renal tissue of control and LN group by Western blot

2.8 相關性分析 經Pearson's相關分析,HMGB1蛋白與p-NF-κB蛋白表達呈顯著正相關（r=0.833,P=0.000）;p-NF-κB蛋白與RAGE蛋白表達呈顯著正相關（r=0.621,P=0.018）;;HMGB1蛋白與RAGE蛋白表達呈顯著正相關（r=0.848,P=0.000）p-NF-κB蛋白與 IκB 蛋白表達呈顯著負相關（r=-0.759,P=0.002）。

3 討論

雄性BXSB小鼠由于攜帶Y染色體連鎖的自身免疫增強基因（Yaa基因）而于第八周齡開始發生自發性自身免疫性疾病,類似于人類SLE,是狼瘡性腎炎研究比較常用的實驗動物模型,其中后期腎臟改變類似人類Ⅳ型狼瘡性腎炎。本研究發現,16周時,BXSB小鼠出現了明顯的狼瘡性腎炎的病理表現即腎小球基底膜增厚、足突融合、內皮下電子致密物沉積,同時腎小球內細胞明顯增生,同時伴有腎功能的下降。上述改變與臨床狼瘡性腎炎的病理變化很相似。

作為一個新型細胞因子,HMGB1在急慢性炎癥性疾病中的作用得到越來越多的重視。已往的研究己經證實,HMGB1參與了多種自身免疫性疾病的發生和發展[2,3]。我們的前期實驗結果顯示,HMGB1是狼瘡性腎炎發病中的一個重要細胞因子,且與蛋白尿的形成有關[1]。本研究顯示,BXSB小鼠外周血中HMGBmRNA及血清中HMGB1蛋白水平均明顯高于正常對照組,提示狼瘡性腎炎發病過程中外周血單個核細胞能夠合成和分泌HMGB1,導致血清中HMGB1水平升高,從而引起腎臟損害。

我們采用免疫組織化學的方法檢測了HMGB1蛋白在腎組織中的定位和表達強度,結果顯示,C57BL/6小鼠腎組織中,HMGB1只表達在腎小管上皮細胞核內,不表達于胞漿和細胞外,說明在正常腎組織中,HMGB1是一種典型的DNA結合蛋白,承擔著“DNA伴侶”作用,在DNA修復、重組、細胞分化中起著重要作用[4];而在BXSB小鼠腎組織中HMGB1蛋白表達升高,主要定位腎小球和腎小管的細胞漿或細胞外,且在細胞增生明顯的腎小球中呈強陽性表達,表明在狼瘡性腎炎發病過程中伴有腎組織中HMGB1的表達升高,而且HMGB1表達的移位與其發揮細胞因子功能進而促進炎癥反應密不可分。但是腎小球中高表達的HMGB1是外周血單個核細胞合成釋放的還是浸潤在腎組織中的淋巴細胞、巨噬細胞合成釋放的抑或是腎小球系膜細胞合成轉位形成的,目前的實驗結果尚不能確定,需進一步實驗證實。

HMGB1最重要的受體之一是晚期糖基化終產物受體（Receptor for advanced glycation end products,RAGE）。RAGE是個多配體受體,屬于免疫球蛋白超家族,是一個能擴大和加劇免疫反應的跨膜蛋白[5]。HMGB1與RAGE之間的結合力強,在部分未成熟的或者惡性程度高的腫瘤中,HMGB1和RAGE兩者共表達,且和腫瘤的轉移和預后密切相關[6-8]。RAGE在腎臟疾病中也具有重要作用,Yamamoto等將人RAGE基因轉導進入動物,使動物強制性表達RAGE,與對照組相比,轉基因動物出現了腎臟增大、腎小球肥大、蛋白尿增加等損害[9]。人類IV型狼瘡性腎炎的腎小球系臟層上皮細胞中也表達RAGE[10]。RAGE能在單核巨噬細胞、血管內皮細胞、腎小球系膜細胞、血管平滑肌細胞等細胞表面表達,通過與其配體結合,趨化單核巨噬細胞,導致血管內皮的損傷,血管炎的形成,并誘導系膜細胞產生多種基質成分使得腎小球發生纖維化[11]。本研究結果顯示,在狼瘡性腎炎腎組織中RAGE蛋白表達明顯高于正常對照組,且與HMGB1蛋白表達升高具有一致性。因此推斷,HMGB1在小鼠狼瘡性腎炎中的致炎作用可能是通過結合RAGE后激發下游反應而實現的。

細胞因子與受體蛋白結合后需要一系列信號轉導分子將信號傳入細胞內。HMGB1與RAGE結合后能激活NF-κB、MAPK、纖溶酶原激活物抑制劑、Cdc42和Rac等信號傳導途徑,傳遞炎癥信息,激發炎癥反應[12]。本研究采用磷酸化NF-κB抗體檢測腎組織中NF-κB蛋白表達,結果顯示,狼瘡性腎炎模型組小鼠腎組織中p-NF-κB蛋白表達顯著高于正常對照組,而IκB低于正常對照組,提示在小鼠狼瘡性腎炎的發病過程中,下調IκB的表達使NF-κB的解離增加,促進NF-κB的核轉位,增加促炎介質的基因轉錄、表達與釋放,從而促進炎癥的級聯反應;同時還發現,RAGE和NF-κB蛋白表達高度正相關,因此推斷,細胞因子HMGB1與其受體蛋白RAGE結合后,觸發一系列級聯過程,使得NF-κB激活和異位,從而引起腎小球細胞的增生。

綜上所述,細胞因子HMGB1參與了狼瘡性腎炎的發病過程,其機制可能是通過與其受體RAGE結合,激活IκB/NF-κB信號途徑,從而介導腎小球細胞的增生及狼瘡性腎炎的發生。

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3 Barkauskaite V,Ek M,Popovic Ketal.Translocation of the novel cytokine HMGB1 to the cytoplasm and extracellular space coincideswith the peak of clinicalactivity in experimentally UV-induced lesionsof cutaneous lupuserythematosus[J].Lupus,2007;16（10）:794-802.

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11 Harashim A,Yamamoto Y,Yamamoto H.AGE-RAGE system in diabetic microangiopathy[J].Nippon Rinnsho,2005;63（Su16）:62-66.

12 Kokkola R,Andersson A,Mullins Getal.RAGE is themajor receptor for the proinflammatory activity of HMGB1 in rodent macrophages[J].Scand JImmunol,2005;61（1）:1-9.

[收稿2009-09-02]

（編輯 許四平）

Effect of NF-κB signal pathway in murine lupus nephritis

FENGXiao-Juan,LIUShu-Xia,ZHANGYu-Jun,GUOHui-Fang,HAOJun,CHENNing,TANGLi-Juan,LIUQing-Juan,WUHai-Jiang.DepartmentofPathology,HebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050017,China

Objective:To investigate the expression andmechanism of NF-κB signal pathway inmurine lupus nephritis.Methods:The BXSBmice aswell as C57BL/6 of 16weekswereused.Transmission electronmicroscope and PASwereused to detect the pathological change of renal tissue.RT-PCR and ELISAwere used to detect the expression of HMGB1mRNA and p rotein.The expression of HMGB1,p-NF-κB,RAGE,IκB and PCNA p roteinwas detected by immunohistochemical stain,FCM and Westernb lot.Results:The level of BUN in serum and Micro-albumin in urine of BXSBmicewas higher than that in C57BL/6mice.The expression ofHMGB1mRNA and HMGB1 protein level in peripheral blood increased significantly in BXSBgroup.Compared with those in controlgroup,electronmicroscopy and PAS revealed the thickness of glomerularbasementmembrane（GBM）,fusion of footprocesses partly of epithelial delland subepithelial electron-dense deposits in the renal tissue of BXSBAmice.Compared with thatof controlgroup,expression of PCNAwas higher in glomeruli of BXSBmouse.HMGB1 proteinoverexpression localized in cytoplasm and extracellularmilieu,especially in proliferativeglomeruliin BXSB group,while the HMGB1 protein primarily confined to the nuclear of tubule in control group.In BXSB group,the expression of p-NF-κB and RAGE increased,while the expression of IκB decreased.Therewere positive correlationbetween the expressionof HMGB1,RAGE and p-NF-κB protein（r=0.833,0.621,0.848,P＜0.01）,while the expression of p-NF-κB protein negatively correlated with thatof IκB.Conclusion:HMGB1 could activate NF-κB through combiningwith its receptor-RAGE,induce the form of proliferative glomerulonephritis by promoting the proliferation of inherent cell of glomeruli,whichmay play an important role in themurine lupusnephritis.

Lupus nephritise;HMGB1;RAGE;NF-κB;IκB;Cell proliferation

R363 R593

A

1000-484X（2010）02-0169-05

①本文為河北省自然科學基金（C2007000828）及河北省衛生廳課題（08055）

封曉娟（1985年-）,女,在讀碩士,主要從事腎臟病理學研究,E-mail:fengxiaojuan1985@163.com;

及指導教師:劉淑霞（1976年-）,女,醫學博士,副教授,碩士生導師,主要從事腎臟病理學研究,E-mail:susanliu1976@163.com。