Cyr61促進RA滑膜細胞增殖及炎癥因子調控研究①

林錦驃 吳娟娟 王 利 鄒 靜 沈佰華 李寧麗

（上海交通大學醫學院上海市免疫學研究所,上海 200025）

Cyr61促進RA滑膜細胞增殖及炎癥因子調控研究①

林錦驃 吳娟娟 王 利②鄒 靜③沈佰華 李寧麗

（上海交通大學醫學院上海市免疫學研究所,上海 200025）

目的:采用類風濕性關節炎（RA）患者滑膜細胞的體外培養,研究基質蛋白Cyr61在RA滑膜細胞增殖中的作用及其機制。方法:通過Real-time PCR、Westernblot和免疫組化檢測RA病人的滑膜組織和細胞中Cyr61的表達情況;用3H-TdR摻入法檢測滑膜液（SF）對滑膜細胞增殖的影響;用ELISA方法檢測RA患者滑膜液中Cyr61蛋白的水平。結果:RA病人的滑膜組織和細胞中高表達Cyr61;SF能刺激滑膜細胞發生明顯增殖;且RA患者滑膜液中含高濃度的Cyr61蛋白。用SiRNA干擾技術抑制滑膜細胞中Cyr61基因表達,再加入滑膜液后,則滑膜細胞增殖明顯降低。同時,將SF與anti-Cyr61抗體共同孵育后再刺激滑膜細胞,FLS也不再發生明顯增殖。進一步研究滑膜液中與上調Cyr61表達有關的炎癥細胞因子,發現SF中IFN-γ和TNF-α具有上調Cyr61蛋白表達的作用。結論:Cyr61蛋白是促進滑膜細胞增殖的重要調控基因;RA患者滑膜液中含有高濃度的炎癥因子IFN-γ和TNF-α,通過上調Cyr61蛋白表達而促進滑膜細胞增殖,可能是促進RA病理性滑膜增生的重要因素之一。

類風濕性關節炎;滑膜液,Cy r61;滑膜纖維樣細胞;TNF-α/IFN-γ

Cyr61（Cysteine-rich 61）是一種分泌性基質蛋白,由381個氨基酸殘基組成。最早于1985年被Lau等在用血清或血小板衍生生長因子（PDGF）刺激小鼠BALB/c 3T3成纖維細胞時所發現。因其結構中富含半胱氨酸（含10%的半胱氨酸殘基）而被命名為富含半胱氨酸Cyr61（Cysteine-rich 61）。Cyr61具有明顯的促有絲分裂活性和趨化性,可誘導成纖維細胞增殖和分泌細胞外基質,參與調節細胞增生、分化、胚胎發育形成,是生命活動的基本蛋白[1-4]。目前,對于Cyr61的研究多集中在腫瘤中,而在類風濕關節炎中的作用尚無報道[5-7]。

本文在采用表達芯片技術對4例RA病人的滑膜組織進行了表達基因表達譜的分析研究,發現Cyr61在RA患者的滑膜組織中顯著升高的基礎上,進一步采用RA滑膜細胞的體外培養、增殖實驗、基因敲除技術等,較為系統地研究了Cyr61在RA滑膜細胞增殖中的作用,結果發現:RA滑液中含有較高濃度的Cyr61蛋白,具有介導RA滑膜細胞增殖的作用。而RA滑液中的炎癥因子TNF-α和IFN-γ能夠上調Cyr61表達,這可能是導致RA病理性滑膜增殖的重要因素之一。這一研究為今后發現治療RA新靶點提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 病人標本 20例RA患者滑膜組織來自于上海光華中西醫結合醫院骨科行膝關節置換或滑膜切除術的RA病人。所有病例的診斷符合1987年美國風濕病協會（ARA）修訂的類風濕關節炎分類標準[8]。其中女性 18例,男性 2例,年齡 40～60歲,病程平均（12±6）年。20例OA患者滑膜組織來自于上海光華中西醫結合醫院骨科行膝關節置換或滑膜切除術的OA病人。所用病例符合Altam提出的關于OA的診斷標準[9]。其中女性13例,男性7例,年齡40～60歲,病程平均（22±8）年。2例正常滑膜組織來自于本校第九人民醫院骨科,為外傷手術病人關節滑膜組織。上述患者滑膜組織用于體外培養（詳見下述）,部分組織用4%多聚甲醛固定后留作免疫組化,血清和滑膜液（SF）高速離心后取上清,-80℃儲存待用。本研究中所用臨床樣本,均對患者進行知情告知并經本院倫理委員會通過。

1.2 滑膜細胞體外培養 將無菌獲取的滑膜組織用PBS清洗后,用無菌手術剪刀反復剪切成約1mm×1mm×1mm的組織塊,加入膠原酶Ⅱ（0.5mg/m l）,37℃、消化2小時后,經 200目紗網過濾,離心去上清后,將細胞重懸于DMEM培養液,置于37℃、5%CO2細胞培養箱內培養。當細胞長成梭形并成片后,進行傳代培養。當細胞傳至第3代后,分別加入FITC標記的小鼠抗人CD3、CD14、CD19和PE 標記的小鼠抗人CD11b進行標記,流式細胞儀檢測鑒定。上述4種標記均為陰性的細胞為成纖維樣滑膜細胞（Fibroblast-like Synoviocytes,FLS）用于本研究。

1.3 Cyr61表達檢測

1.3.1 Real-time PCR檢測Cyr61表達 采用ABI公司提供的軟件prism2.0設計所檢測基因表達引物,序列見表1。Real-time PCR操作與結果分析同以前報道[10]。簡述之:收集滑膜組織與FLS,用Trazol提取RNA,經隨機引物逆轉錄為cDNA后,將熒光染料SYBRGreen和目的基因Cyr61與內參GADPH的引物混勻后,加入 Real-time PCR檢測板、密封、上機檢測（ABI 7900）。所采用的反應條件為:50℃2分鐘,95℃10分鐘,95℃15秒,60℃60秒,共 40個循環。根據PCR反應信號強度Ct值計算每個樣本的Cyr61基因相對表達量。

表1 Real-time PCR檢測基因及引物序列Tab.1 Gene and primer sequence for Real-time PCR

1.3.2 免疫組織化學檢測滑膜組織Cyr61表達將所獲取的滑膜組織用4%多聚甲醛固定,經脫水、包埋、切片固定等常規方法獲得滑膜組織切片。經常規二甲苯脫臘、梯度酒精脫苯、洗滌后進行Cyr61免疫組化染色。簡述之:首先用兔血清封閉切片的非特異性抗原、去血清后加1∶50的羊抗人Cyr61多克隆抗體（Sant Cruz,USA）及抗人IgG作為空白對照,4℃過夜后,洗滌、加生物素標記的兔抗羊IgG,室溫20分鐘后加辣根過氧化物酶標記的鏈霉素親和素標記抗體,經DAB緩沖液顯色,中止后用蘇木素復染,常規脫水,透明封片。顯微鏡下拍照（×40）,并采用圖像分析法對免疫組化結果進行相對定量分析。

1.3.3 Western blot檢測FLS細胞Cyr61蛋白表達常規Western blot方法檢測FLS中Cyr61表達。

1.4 ELISA方法檢測滑膜液中Cyr61蛋白 采用自制的鼠抗人Cyr61單克隆抗體（將另文報道）包被ELISA板,其余同常規ELISA方法。簡述之:鼠抗人Cyr61單克隆抗體包被（1μg/孔）并于4℃過夜,次日用1%BSA-PBS封閉2小時,加入RA患者滑膜液及骨關節炎患者滑膜液各30份及RA患者血清20份,

100μl/孔。同時加入倍比稀釋的hCyr61標準蛋白（200、100、50、25、12.5、6.25、3.13、0 ng/ml）。經37℃孵育1小時后,加入市售羊抗人Cyr61抗體（Sant Cruz,USA）100μl/孔,孵育后加辣根過氧化物酶標記的兔抗羊IgG抗體工作液、OPD底物顯色、終止反應后于酶標儀上測定OD（492 nm）值,根據hCyr61標準蛋白測定的OD值制作標準曲線,獲得待測樣品中Cyr61蛋白濃度。

1.5 成纖維樣滑膜細胞增殖實驗和抗體中和實驗將 FLS接種于 96孔細胞培養板中,每孔2×103cells/孔/200μl。37℃、5%CO2培養箱孵育 12小時后,加入不同稀釋度的RA滑膜液,繼續孵育24小時,加入3H-TdR（1μCi/孔）,再培養 18小時,收集細胞,加液體閃爍液,β計數儀檢測cpm值。抗體中和實驗:FLS接種至96孔培養板中,將抗人Cyr61單抗按照 1∶25、1∶50、1∶100 比例加入 SF 中混勻 ,同時設無關單抗（1∶25）為對照。經與滑膜細胞培養24小時后加3H-TdR（1μCi/孔）,再培養18小時,收集細胞,加液體閃爍液,β計數儀檢測cpm值以觀察FLS的增殖作用變化。

1.6 Cyr61 SiRNA干擾實驗 根據GeneBank數據,人工合成隨機SiRNA（上海吉瑪制藥技術有限公司）3對。采用Real-time PCR對于所合成的SiRNA干擾效果進行篩選。選用干擾效果達70%的SiRNA進行Cyr61干擾實驗。簡述之:在5×104FLS中加入轉染試劑（Lipofectin 2000,USA）與對照 SiRNA（稱SiNC）和 Cyr61特異性 SiRNA（SiCyr61）,混勻后,37℃、5%CO2培養,24～48小時后,取被干擾細胞進行Cyr61相對表達量檢測,檢測干擾效果和對于滑膜細胞增殖的影響（滑膜細胞增殖測定方法同上）。

1.7 細胞因子刺激和抗體中和實驗 將重組人IL-10、IL-12、IFN-γ、TNF-α加入培養的 FLS中 ,8小時后Real-time PCR檢測Cyr61的mRNA表達水平。所用細胞因子濃度為:IL-10 0.1 ng/ml,IL-12 0.5 ng/ml,IFN-γ0.05 ng/ml,TNF-α0.05 ng/ml,滑膜液（1∶5 稀釋）作為陽性對照。細胞因子抗體阻斷實驗:將抗IFN-γ（10 μg/m l）和抗 TNF-α（200 ng/ml）分別與IFN-γ、TNF-α、滑膜液混勻后加入滑膜細胞共同孵育,8小時后檢測Cyr61的mRNA表達水平。

1.8 統計學分析 采用Grafpphad prism 5.0進行作圖和分析。實驗數據以±s表示,組間比較采用t檢驗,P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 RA患者滑膜組織中Cyr61表達增高 本實驗室前期運用基因芯片檢測發現Cyr61基因在RA滑膜組織中表達遠遠高于正常人和骨關節炎（OA）患者滑膜組織（圖1A）,為明確RA病人FLS中Cyr61的表達情況,我們應用Real-time PCR分析了10例RA患者外周血、關節液和滑膜組織來源的單個核細胞及滑膜組織中Cyr61mRNA的表達水平。結果可見:RA患者的滑膜組織Cyr61基因的相對含量比RA患者的外周血、關節液和滑膜組織來源的單個核細胞以及正常人的外周血單個核細胞分別高8.7倍、125倍及13.3倍（P＜0.05）,證實了基因芯片的結果。進一步用免疫組化染色的方法觀察了Cyr61在滑膜組織不同細胞中的分布及蛋白表達水平。結果發現:與OA及正常滑膜組織相比,RA患者滑膜襯里層和襯里下層巨噬細胞樣滑膜細胞浸潤,血管增生,大量淋巴細胞,漿細胞和單核細胞浸潤,淋巴濾泡形成伴纖維素樣壞死,FLS增生,而OA與正常人滑膜組織僅少量Cyr61表達（圖1C）。采用圖像分析證實了這一結果（圖1D）。

圖1 RA患者組織及細胞中Cyr61基因的相對含量表達格局Fig.1 Relativeexpression of Cyr61 in synovial tissues and cells of RA patients

圖2 體外培養的RA FLS中高表達Cyr61Fig.2 Overexpression of Cyr61 in RA FLS in vitro

2.2 RA病人滑膜成纖維細胞Cyr61表達增高 為深入研究RA患者滑膜細胞中Cyr61表達與作用機理,我們在體外培養了滑膜細胞（FLS）并用Real-time PCR分析了FLS中Cyr61mRNA的表達格局。結果可見:在RA患者的FLS中Cyr61基因的相對含量明顯高于滑膜組織（圖2A）,說明Cyr61主要在RA滑膜組織的成纖維樣滑膜細胞中表達增高;同時我們還比較了RA、OA和正常人培養至第3代的FLS中Cyr61mRNA的表達水平。如圖2B所示,在RA患者的FLS中Cyr61基因的相對表達量比OA患者和正常人的FLS分別高3.5倍、20倍,從mRNA水平上證實了Cyr61在 RA病人 FLS表達增高。進一步用Western blot的方法對RA、OA和正常人的FLS進行Cyr61蛋白表達水平檢測。結果表明 RA FLS中Cyr61表達水平明顯高于OA和正常人FLS,從而驗證免疫組化的結果,更加證明Cyr61主要表達在滑膜的成纖維樣細胞中（圖2C）。

2.3 RA的滑膜液（SF）刺激FLS增殖與Cyr61表達為了觀察局部炎癥環境對于FLS的生物學效應和Cyr61表達的影響,我們將RA患者的滑膜液（SF）加入培養的細胞中,采用Real-time PCR和Western blot觀察滑膜液對FLS中Cyr61mRNA和蛋白表達的影響。結果表明:RA滑膜液能夠促進FLS中Cyr61mRNA和蛋白表達（圖3A）。進一步采用3H-TdR摻入法,觀察不同濃度滑液對于RA-FLS增殖的影響。結果表明:與對照組相比,各劑量組滑膜液均能促進RA FLS增殖并呈劑量依賴性（圖3B）。

圖3 不同濃度滑膜液對于FLS Cyr61表達和增殖的影響Fig.3 Enhancement of FLSexp ression of Cyr61 and proliferation by synovial fluid

圖4 RA滑液中Cyr61含量與抗Cyr61抗體阻斷實驗Fig.4 Concentration of Cyr61 in RA SF and anti-Cyr61 neutralization assay

2.4 RA患者SF中Cyr61濃度增高,抗Cyr61抗體能夠阻斷SF促進FLS增殖 由于Cyr61是一種分泌性蛋白,具有明顯的促有絲分裂活性,可誘導成纖維細胞增殖。而我們的實驗也證實RA病人滑膜細胞中高表達Cyr61蛋白,為此我們采用本室制備的鼠抗人Cyr61單抗檢測RA SF（n=30）中Cyr61蛋白的含量,并與OA SF和RA患者外周血清相對比。結果顯示:RA SF中Cyr61蛋白明顯高于對照OA SF,RA患者外周血（圖 4A）。而進一步采用抗人Cyr61單抗進行中和實驗,結果發現:Cyr61單克隆抗體能夠中和RA-SF刺激滑膜細胞增殖的作用,并且呈劑量依賴性。當RA-SF稀釋到1∶100,阻斷作用基本消失（圖4B）。表明Cyr61蛋白具有刺激滑膜細胞增殖作用。

圖5 Cyr61特異性基因干擾實驗圖Fig.5 Specific Cyr61 SiRNA in RA FLS

圖6 IFN-γ和TNF-α均可上調RA FLS中 Cyr61的表達Fig.6 Elevated expression of Cyr61 by IFN-γand TNF-αin RA FLS

2.5 特異性基因干擾實驗驗證Cyr61具有促進FLS增殖作用 我們分別設計了3條針對人Cyr61基因的雙鏈小RNA（SiRNA）,同時用與哺乳動物無關的SiRNA作為陰性對照（SiRNA of Negative control,siNC）。用脂質體（Lipofectin2000）將SiRNA轉染到細胞中,光學顯微鏡圖和熒光顯微鏡觀察表明轉染率達80%～90%。用Real-time PCR檢測干擾24小時后Cyr61的表達水平,其中H-3是針對人Cyr61的特異性SiRNA,抑制率約為 70%～80%（圖5A）,因此,選用這一SiRNA進行FLS增殖實驗。進一步觀察了干擾的最佳時間,發現干擾24小時效果最好（圖5B）。因此,采用干擾24小時,結果表明當FLS中Cyr61表達受到干擾時,FLS受到滑液刺激后的增殖明顯降低（圖5C）,提示Cyr61是介導SF刺激后滑膜細胞增殖的重要基因。

2.6 RASF中 IFN-γ和TNF-α可上調Cyr61表達由于SF中含有高濃度的細胞因子[11],為了明確這些細胞因子是否與Cyr61上調有關,本研究中用純化的細胞因子分別刺激RA FLS,觀察其Cyr61的表達情況。為了模擬其在體內的作用,細胞因子的濃度選擇為在SF中能夠檢測到的濃度。結果表明:IFN-γ和TNF-α能夠上調Cyr61的表達（圖 6A）。為了明確該兩種細胞因子的作用,進而采用阻斷抗體anti-IFN-γ（10μg/ml）和 anti-TNF-α（200 ng/ml）分別與SF混勻,在刺激8小時后收集培養的細胞,使用Real-time PCR的方法檢測其Cyr61的表達水平。結果顯示:用IFN-γ和TNF-α抗體阻斷后,SF的刺激作用也明顯下降,聯合阻斷的作用更明顯（圖6B）。

3 討論

類風濕性關節炎（Rheumatoida athritis,RA）是一種以滑膜組織炎性增生、關節進行性破壞為特征的慢性炎癥性自身免疫性疾病。其病因尚不明確,最近研究發現,除了細胞因子和Th1/Th2細胞失衡外,非T細胞成分如FLS（Fibroblast-like synoviocytes,FLS）具有轉化細胞的特性,RA異常增生的滑膜組織類似于局限性侵襲生長的腫瘤,造成關節的破壞[12-15]。有研究報道,滑膜組織增生與癌基因和凋亡相關基因具有相關性,但Cyr61在RA滑膜組織增生中的作用,尚未見報道。

本實驗室前期運用表達基因芯片檢測發現Cyr61基因在RA滑膜組織中表達增高。為進一步驗證此結果,我們應用Real-time PCR分析了RA患者外周血、關節液和滑膜組織來源的單個核細胞,以及完整滑膜組織中Cyr61的表達水平,結果發現,RA患者的滑膜組織Cyr61基因的相對含量高于患者的外周血、關節液和滑膜組織來源的單個核細胞以及正常人的外周血單個核細胞。證實了用表達芯片所獲得結果。而用免疫組化也證實了只有RA滑膜組織高表達Cyr61,蛋白表達主要存在于滑膜襯里層細胞及襯里下層血管內皮細胞、FLS。而OA患者和正常人的滑膜組織細胞中Cyr61表達比較微弱,并只分布在滑膜襯里層細胞中。

為了深入研究Cyr61在RA滑膜組織中高表達的病理意義,我們首先建立了RA滑膜細胞的體外原代培養,并獲得純化（原代培養第3代后）的纖維樣滑膜細胞（FLS）。在基因和蛋白水平上與OA和正常人滑膜組織的FLS進行比較,明確了RA FLS中Cyr61的表達明顯高于OA和正常人FLS。在此基礎上,我們研究了Cyr61表達與關節滑膜液、FLS增殖及與炎癥因子的關系。

我們首先用不同濃度的滑膜液刺激體外培養的滑膜細胞,發現RA的SF能上調FLS中Cyr61表達,同時促進FLS增殖,而且Cyr61表達和FLS增殖均與滑液加入量呈正相關,即表現出典型的劑量依賴性。由于RA FLS中高表達Cyr61蛋白,而Cyr61又是一種分泌蛋白,因此我們推測RA SF中可能存在Cyr61蛋白,這一推測通過ELISA檢測了RA和OA SF中Cyr61的含量得到證實:RA SF中Cyr61蛋白含量明顯高于對照OA SF和RA患者外周血。而將抗Cyr61單克隆抗體加入SF,用于中和Cyr61作用,結果顯示這種處理后,SF刺激FLS增殖的能力明顯下降,說明Cyr61的確能夠增強SF刺激FLS增殖的作用。

RNA干擾（RNA interference,RNAi）是近幾年才發現的一種生物學現象,它由長21～23個堿基對的雙鏈RNA介導,通過堿基互補配對,導致序列特異的基因沉默。目前,RNA干擾已被廣泛應用于探索基因功能、防治病毒感染以及治療腫瘤[16-18]。小干擾RNA（Small interfering RNA,SiRNA）抑制效率高,可達90%以上,而且沒有明顯的毒副作用。因此是近年應用最為廣泛的特異性基因功能研究方法。我們針對Cyr61mRNA三個不同位點設計了三組SiRNA,并通過干擾后Cyr61表達變化篩選出干擾效率最高的Cyr61特異性SiRNA。用這一SiRNA轉染FLS,干擾FLS中Cyr61基因表達,發現SiRNA干擾后,再用SF刺激,FLS增殖明顯下降,證實了Cyr61的確是介導FLS增殖的關鍵基因。

由于RA SF中含有多種高濃度的細胞因子為RA滑膜炎提供了重要的微環境,在RA的發生和發展起重要作用[19,20]。我們推測SF中含有某些炎性細胞因子可能參與了Cyr61表達的上調。為了驗證這一想法,我們用純化的細胞因子IL-10、IL-12、IFN-γ和TNF-α分別刺激FLS,結果發現只有IFN-γ和TNF-α能夠上調FLS中Cyr61表達。進一步采取抗IFN-γ和抗TNF-α中和抗體分別或同時與SF預孵育,以達到中和 SF中TNF-α和 IFN-γ的目的,然后再用這種預處理的SF刺激FLS,結果顯示此時的SF刺激FLS增殖的作用明顯下降。提示:RA SF含有的高濃度TNF-α和IFN-γ能夠通過上調滑膜細胞中Cyr61表達,繼而,Cyr61促進滑膜細胞增生。

關于滑膜組織增生與癌基因和凋亡相關基因的關系已有研究報道[21-23],但是Cyr61與RA滑膜細胞增殖則未見報道。本研究首次報道了Cyr61蛋白介導RA滑膜增殖,而SF中的炎癥因子TNF-α和IFN-γ能夠上調Cyr61表達。這可能是導致RA病理性滑膜增殖的重要因素之一。這為今后進一步篩選治療RA新靶點提供實驗依據。但是,關于Cyr61如何促進滑膜細胞增殖及其調控機制尚待進一步研究。

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[收稿2009-11-08]

（編輯 張曉舟）

Cyr61 promotes proliferation of fibroblast-like synoviocytes in rheumatoid arthritis and its regulation by inflammatory factor

LINJin-Piao,WUJuan-Juan,WANGLi,ZOUJing,SHENBai-Hua,LINing-Li.ShanghaiInstituteofImmunology,ShanghaiJiaotongUniversitySchoolofMedicine,Shanghai200025,China

Objective:To investigate the effectof Cyr61 on the proliferation of Fibroblast-like Synoviocytes（FLS）in rheumatoid arthritis（RA）.Methods:Cyr61 expression in synovial tissues（ST）and FLSwas examined using Real-time PCR,Westernb lot and immunohistochemistry simultaneously.FLSwere isolated from synovial tissueof RA patients and cultured in vitro.The proliferation of FLSstimulated with synovial fluid（SF）was determined by3H-TdR incorporation.Cyr61 protein level in RA SF was detected by ELISA.Results:Cyr61 was over expressed in ST,FLSof RA patientswhilehardly examined in normal individuals and osterarthritis（OA）patients.Meanwhile,Cy r61 protein level was elevated in SF,which promoted the proliferation of RA FLS.This proliferation was abrogated by knockdown the Cyr61 gene of FLS or neutralizingmonoclonal antibody againsthuman Cyr61.Moreover,inflammatory factor IFN-γand TNF-αup-regulated the expressionof Cyr61.Conclusion:These results indicate that the elevated level of IFN-γand TNF-αin RA SF can promote the proliferation of the FLS derived from RA patients by increasing expression of Cyr61,suggesting that Cyr61may play an important role in the development of RA.

Rheumatoid arthritis;Synovium fu lid,Cyr61;Fibroblast-like synoviocytes;TNF-α/IFN-γ

R392

A

1000-484X（2010）03-0264-06

①本文受國家自然基金（30872990）、863項目（2008AA02Z429）、上海市科委（08JC1413200）、上海市教委（J50207）、仁濟醫院基礎醫學院合作研究基金項目（PY07011）資助

②上海交通大學醫學院免疫學教研室,上海200025

③上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院呼吸科,上海200025

林錦驃（1985年-）,男,在讀碩士,主要從事自身免疫與免疫調節研究,E-mail:jinpiaolin@yahoo.com.cn;

及指導教師:李寧麗（1957年-）,女,博士,教授,主要從事自身免疫與免疫調節研究,E-mail:ninglixiaoxue57@yahoo.com.cn。