絲狀真菌蛋白質組學研究①

張 宇 賀 丹 王 麗 (吉林大學白求恩醫學院病原生物學系,長春130021)

真菌是自然界中廣泛存在的一類重要微生物,與人類的生產、生活密切相關。絲狀真菌作為其中的類群,在食品、藥品、酶劑、有機酸的生產和農業的生物防治等方面發揮著極大的作用。但另一方面,其中某些種屬也是人和動、植物的重要致病菌[1,2]。為了有效地開發利用真菌資源,防治真菌病害、控制真菌感染,研發新型抗真菌藥物和真菌疫苗,有關絲狀真菌代謝途徑、致病機制等的研究尤為重要。

絲狀真菌是多細胞真核生物,其生長、代謝等活動是復雜的過程,在復雜的系統中完成。在各系統中,有一些功能單元,它們協同作用并互相整合,其最終執行者就是蛋白質。以往的研究只是針對某種或幾種“關鍵”蛋白質,難以從整體上系統地闡釋生命活動的機制。隨著后基因組時代的到來,蛋白質組學(Proteomics)技術的應用對絲狀真菌的生命活動、致病機制、代謝途徑等研究起到了極大的推進作用。

雙向凝膠電泳可以同時分離上千種蛋白質,并且與后續的質譜(如：基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(matri assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS))和大規模數據處理及圖像分析軟件相銜接,形成了蛋白質組學的核心技術。但是存在著檢測靈敏度低、染色方法與質譜難以整合、低豐度蛋白質無法鑒定等問題。近年來,同位素標記和熒光標記技術的應用、串聯質譜分析測定技術的開展、肽序列標簽(Peptide sequence tag,PST)技術的應用很大程度上促進了蛋白質組學的發展。

本文主要從絲狀真菌的胞內蛋白質組學、亞蛋白質組學和分泌蛋白質組學三個方面進行闡述。

1 胞內蛋白質組學(Intracellular proteomics)

在絲狀真菌,最初是針對胞內蛋白質進行研究。2002年,Herna′ndez-Macedo等[3]率先開展了胞內蛋白質組研究。他們應用雙向凝膠電泳技術,比較了木質素降解菌黃孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)在鐵存在和缺失狀態下,胞內蛋白質的差異表達,發現了21種與鐵吸收相關的蛋白質。2004年,Grinyer等[4]首次將質譜測定法用于絲狀真菌蛋白質的鑒定。他們在哈茨木霉(Trichoderma harzianum)蛋白質的雙向凝膠電泳圖譜中選擇96個蛋白質點,利用質譜技術得到肽質量指紋圖譜(Peptide mass fingerprinting,PMF),通過檢索數據庫鑒定出其中25個,如熱休克蛋白、磷酸甘油酸酯激酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、6-磷酸葡萄糖脫氫酶等。這些開創性的工作極大地推動了絲狀真菌蛋白質組學的研究。

隨著科學技術的不斷發展,蛋白質組學技術體系也不斷成熟和發展,并用于絲狀真菌的代謝途徑、致病機制等方面的研究。

煙曲霉(Aspergillus fumigatus)是非常重要的條件致病菌,相關研究成為熱點。利用蛋白質組學方法,可以獲得環境變化和外界壓力條件下菌株的蛋白質表達變化,如對氧化應激的反應等[5]。這其中的許多蛋白質與致病性或毒力因子的調節相關,如熱休克蛋白、硫氧還蛋白、谷胱甘肽過氧化物酶以及超氧化物歧化酶等,他們在菌株處于氧化應激狀態時的表達量增高,使菌體避免宿主免疫細胞的損傷作用,參與菌株的致病過程。蛋白質組學方法也可以發現新的抗原,為煙曲霉感染疾病的診斷提供候選標志物。此外,蛋白質組學方法也可用于研究菌株代謝途徑的調節。Kniemeyer等[6]比較了不同碳源存在時,煙曲霉的胞內蛋白質表達情況,闡述了其碳代謝的抑制因素。Carberry和Martin等[5,7]鑒定出的蛋白質如丙氨酸轉氨酶、烏頭酸水合酶、鳥嘌呤核苷酸結合蛋白亞單位等,這些蛋白質都是菌株糖類、脂類、蛋白質代謝過程中的關鍵酶,功能涉及細胞代謝、蛋白質的合成與轉運等。這些數據不僅完善了煙曲霉蛋白質數據庫,還將為深入探討煙曲霉的致病機制以及生長代謝的過程提供資料。其他條件致病菌的相關研究也不斷深入。K im等[8]將構巢曲霉(Aspergillus nidulans)和產乳酸菌共培養,發現菌株形態相關蛋白質的表達水平發生了變化。Leng等[9]研究了紅色毛癬菌(Trichophyton rubrum)分生孢子的蛋白質組,發現許多特異蛋白質與孢子的生長和播散相關,可以更好地研究分生孢子萌發和維持休眠狀態的分子機制,為闡明菌株的致病機制奠定基礎。

蛋白質組學方法為一些植物致病菌感染過程的研究提供了重要信息。Fernández-Acero等[10]建立了灰葡萄孢霉(Botrytis cinerea)的蛋白質數據庫,功能主要涉及蛋白質代謝、形態變化和氧化還原活性等,如草酸、漆酶、過氧化氫酶等。這些蛋白質在菌體侵染植物時,釋放出能夠清除活性氧的代謝產物,保護菌體不受損傷,為植物病害的判斷和殺菌劑的開發提供了良好的來源。另一種植物致病菌核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum)的蛋白質組圖譜的繪制也已完成[11],推測其中的α-L-阿拉伯呋喃糖酶與致病性相關。Noir等[12]研究經水仙花堿作用后布氏白粉菌(Blumeria graminisf)的分生孢子蛋白質組圖譜。鑒定出180種蛋白質,功能涉及糖類、脂類和蛋白質的分解代謝,說明此時孢子已為增殖、萌發儲備能量,參與侵染植物的過程。Lakshman等[13]分離了立枯絲核菌(Rhizoctonia solani)胞內全部蛋白質,鑒定出11種與生物防治功能相關的蛋白質,探討了其生物功能以及宿主與病原菌間的相互作用。

雖然已在整體水平上逐漸勾畫出絲狀真菌的代謝和致病過程相關的蛋白質組圖譜,但仍存在著一些問題,如位于細胞器上許多重要的調節分子(如信號轉導蛋白、細胞調節因子及轉錄因子)和疏水性、堿性蛋白質很難被檢測到。因此,目前,絲狀真菌蛋白質組研究的熱點逐漸轉向亞細胞(如細胞壁、質膜、細胞器、細胞質和細胞核)的蛋白質。

2 亞蛋白質組學(Subproteomics)

亞蛋白質組學研究的是亞細胞(如細胞壁、質膜、細胞器等)的全部蛋白質[14]。細胞壁是微生物與外界環境相互作用的直接界面。它的結構復雜,錨定和排列著許多蛋白質,在形態發生、粘附、致病性、抗原性方面發揮著重要作用。其中許多已經成為抗真菌藥物研發的潛在靶標。但由于其低豐度、低溶解性、疏水性、廣泛的糖基化以及共價結合于細胞壁的多糖骨架上等原因,許多細胞壁蛋白質難以分析。Pitarch等人[15]建立了絲狀真菌細胞壁蛋白質提取方法,并進行蛋白質組分析。不僅得到了蛋白質組圖譜,而且提出了蛋白質間以及蛋白質與細胞壁結構間的相互作用機制。張成省等[16]以鏈格孢霉(Alternaria alternata)為研究對象,比較了冷堿、熱堿和SDS法提取菌絲細胞壁可溶性蛋白質的方法,為探討病原菌與宿主間的相互識別機制奠定了基礎。Asif等[17]為了研究煙曲霉潛在的藥物靶點,繪制了該菌的質膜表面蛋白質組圖譜。利用細胞壁和質膜的亞蛋白質組學,可以系統地研究菌株的蛋白質分泌和發現新的藥物靶點等。

線粒體的相關研究也成為熱點。Grinyer等[18]首次建立了成熟的樣品制備方法,得到哈茨木霉線粒體蛋白質組圖譜,鑒定出25種線粒體特有蛋白質,其功能涉及三羧酸循環、分子伴侶、受體結合與運輸以及結構蛋白等方面。Schmitt等[19]分析了粗糙脈孢霉(Neurospora crassa)的線粒體質膜蛋白質組,鑒定出30種蛋白質,其功能涉及物質運輸和線粒體形態變化等。

Grinyer等[20]也首次分離和鑒定出里氏木霉(Trichoderma reesei)20S蛋白酶體的13個亞基,繪制了絲狀真菌蛋白酶體的蛋白質組圖譜。

這種方法的優點是：以細胞器蛋白質作為研究對象,與胞內總蛋白質相比,降低了樣品的復雜性,而且細胞的功能單位如細胞器、大分子結構或多蛋白復合體也不會遭到破壞,可以獲得低豐度的調節分子和疏水性、堿性蛋白質,亦可以在特定細胞器的特定生理狀態下深入了解蛋白質的功能。

3 分泌蛋白質組學(Secretome)

分泌蛋白質組學研究的是絲狀真菌分泌蛋白質和與分泌過程相關蛋白質[21]。絲狀真菌是腐生菌,需要分泌大量的胞外酶來降解多種物質,以攝取養分、改善生存環境等。對這些分泌蛋白質的研究不但有助于了解其代謝途徑和致病機制[7,11],而且在重組蛋白的生產中也有著重要意義[22]。Medina等[23]初步建立了真菌分泌蛋白質組樣品制備方法,鑒定出蘆丁誘導下黃曲霉(Aspergillus flavus)分泌參與降解的蛋白質。Oda等[24]發現了在液體和固體培養狀態下米曲霉(Aspergilllus oryzae)分泌蛋白質的差異表達。Suárez等[25]比較了以幾丁質或其他真菌(絲核菌(Rhizoctonia solani)和灰葡萄孢霉等)細胞壁為唯一碳源時,哈茨木霉的分泌蛋白質表達存在顯著差異,表達量最高的均是一種新型的天冬氨酸蛋白酶(P6281),提示這種蛋白質在其腐生生活中起主要作用。Paper等[26]鑒定了禾谷鐮刀菌(Fusarium graminearum)的分泌蛋白質。結果發現體外培養時91%～100%的分泌蛋白質具有信號肽;感染小麥時,只有56%的分泌蛋白質具有信號肽,提示這些蛋白質在禾谷鐮刀菌與其宿主植物的相互作用中發揮著重要作用。

分泌蛋白質的分泌量少,低豐度蛋白質獲取困難,因此開展全部分泌蛋白的研究較少。但研究分泌蛋白質的優點是：菌株的生長環境便于控制,蛋白質獲取過程直接,其他來源(如細胞內、質膜等)蛋白質的干擾較少等。隨著蛋白質組學技術的發展,低豐度蛋白質的富集成為可能,絲狀真菌的分泌蛋白質組學研究必將迅速開展。

綜上,近年來由于高通量、高靈敏度和規模化的雙向凝膠電泳-質譜等技術的飛速發展,絲狀真菌蛋白質的研究已經取得了較大的成果。雖然作為“新生”領域,仍存在著一些不足,但隨著先進技術方法的不斷產生和完善、基因組學與生物信息學技術的發展以及政府投資與商業投入的不斷增加,絲狀真菌蛋白質組學研究必將在21世紀取得突破性的進展。

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