博萊霉素誘導小鼠肺間質纖維化造模方式的選擇

李麗娜 王 華 周 蕾 張永勝 于永利 王麗穎 孫陸果

（吉林大學白求恩醫學院分子生物學教研室,長春 130021）

博萊霉素誘導小鼠肺間質纖維化造模方式的選擇

李麗娜 王 華 周 蕾 張永勝 于永利①王麗穎 孫陸果

（吉林大學白求恩醫學院分子生物學教研室,長春 130021）

目的:建立博萊霉素導致肺間質纖維化小鼠動物模型,比較不同給藥方式的成模差異。方法:利用8周齡雄性ICR小鼠,①隨機分為腹腔給藥組（P組）、氣管內給藥組（I組）、陰性對照組（C組）,分別經腹腔注射BLM 40mg/kg 5次、氣管內滴入BLM 5mg/kg 1次或氣管內滴入生理鹽水50μl。分別于14、28、40天處死,②小鼠隨機分為4組,分別經腹腔注射BLM 40 mg/kg3、4、5次或經腹腔給予生理鹽水200μl。分別于28、40天處死。觀察小鼠體重、咳嗽、撓鼻癥狀、肺系數及肺組織病理改變。結果:給予博萊霉素后①小鼠的體重均下降并出現咳嗽及撓鼻等呼吸障礙癥狀;處置后第14、28及40天處死小鼠,計算肺系數,P組較I組肺系數高;處死小鼠后,P組和I組小鼠均形成廣泛、穩定的間質纖維化病理改變,P組主要分布在胸膜下及血管周圍,而I組主要分布在肺門和支氣管周圍。P組較I組肺纖維化病理評分高。②不同腹腔給藥次數模型小鼠體重變化以5次給藥對體重影響最大;計算肺系數以給藥5次肺系數變化最大。上述模型均成功建立。通過比較生存率、呼吸困難癥狀、組織病理變化等指標,選出腹腔給藥5次相對于給藥3次及4次為更好的造模方式。結論:利用BLM腹腔注射和氣管內滴入制備了肺間質纖維化動物模型,纖維化形成的部位存在著一定的差異,腹腔給藥5次方法制備肺間質纖維化模型的成功率更佳。

ICR小鼠;博萊霉素;肺間質纖維化

肺纖維化一般指在毒物、自發免疫反應、藥物副反應、感染、嚴重的外傷等不同因素刺激下引起肺部炎癥反應,肺泡持續性損傷、細胞外基質反復破壞、修復、重建并過度沉積,導致正常肺組織結構改變、功能喪失的一類疾病,是所有間質性肺疾病的終末結局,其發生、發展關系到這一大類疾病的研究進展。目前我國還沒有明確的流行病學調查資料,美國的一項調查顯示18～34歲人群的特發性肺間質纖維化（Idiothomeol pulmonary fibrosis,IPF）,患病率約為7/10萬,75歲以上人群的IPF患病率為227.2/10萬,年發病率約為1.2～76.4/10萬[1]。主要表現逐漸加重的呼吸困難,伴有刺激性干咳,病情一般持續發展,最終因呼吸衰竭而死亡;至今無有效的藥物能逆轉肺纖維化的自然過程及其終末結局;預后差,確診后平均生存時間2～3年。

博萊霉素是從鏈霉菌屬中一個產抗生素株中提取出的糖肽類物質。臨床上,博萊霉素常用于治療淋巴瘤、辜丸癌、鱗狀細胞癌等。使用博萊霉素早期可出現全身炎癥反應及類似肺炎癥狀,而后期則產生進行嚴重的肺纖維化[2]。由于其導致動物肺間質纖維化模型與人類肺間質纖維化病理過程相似,所以常被用來制作肺纖維化的動物模型。為建立一種比較適合肺纖維化發病及治療的造模方式,先后有學者選用了腹腔給藥、氣管滴入、尾靜脈給藥及霧化吸入等方法[3-6],但尾靜脈給藥法成模率較低,霧化吸入法成本較高,因此本研究比較了腹腔、氣管給予博萊霉素及經腹腔給予不同劑量的博萊霉素建立肺間質纖維化模型的效果,以選用最為簡便及成模率高的方式從而進行下一步研究。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 雄性SPF級ICR小鼠,8周齡,體重18～22克,由吉林大學白求恩醫學院實驗動物中心提供。博萊霉素粉劑每支8mg（哈爾濱博萊制藥有限公司）,戊巴比妥鈉由Serva進口分裝。

1.2 方法

1.2.1 動物模型建立 小鼠飼養于IVC鼠籠中,室溫（24℃～26℃）,保持濕度,日照 14小時和黑夜10小時交替進行,墊料、食物和水滅菌處理。實驗過程中不限制食水。具體造模方法:氣管給藥組（I組）實驗小鼠用4%水合氯醛（0.01m l/g）150μl腹腔注射麻醉后,取仰臥固定位,常規消毒,行頸正中切口,鈍性分離暴露氣管,于氣管軟骨環間隙穿刺緩緩注入BLM（5mg/kg）0.05 ml,。注藥后立即將小鼠直立旋轉3～5分鐘,使藥液均勻分布于兩側肺內,然后縫合皮膚,并在縫合處消毒,待清醒后常規飼養。手術前一日及術后三天連續肌肉注射青霉素（0.05 m l/只）。腹腔給藥組于實驗0、2、4、6、8天于腹膜腔注射BLM（40mg/kg）200μl 3、4或5次,C組注入等體積生理鹽水,P 組分別于實驗0、2、4、6、8 天于腹膜腔注射BLM（40mg/kg）200μl。

1.2.2 小鼠體重監測 測量每只小鼠每日體重,記錄體重變化,并觀察小鼠毛色、活動狀態等變化。

1.2.3 觀察小鼠咳嗽及撓鼻癥狀 記錄每5分鐘每只小鼠咳嗽及撓鼻次數。

1.2.4 計算肺系數 各組小鼠分別于給藥后第14、28、40天采用摘除眼球造成急性大量失血的方法處死,分離出雙肺,分離干凈后放入冰冷生理鹽水中漂洗除去血液,用濾紙洗凈表面的血液后,稱肺重,按如下公式計算肺系數:肺系數=肺濕重（mg）/體重（g）。

1.2.5 肺組織病理學觀察 取右肺下葉,4%中性福爾馬林固定一夜后,按常規病理學方法脫水、包埋、切片、分別進行HE染色及Masson染色。染色后切片參照Szapiel[7]方法確定肺泡炎和肺纖維化程度。具體如下:1）肺泡炎:分為4級①無肺泡炎0分;②輕度肺泡炎l分:單核細胞浸潤使肺泡隔增寬,僅限于局部和近胸膜部,面積小于全肺的20%,肺泡結構正常;③中度肺泡炎2分:受累面積占全肺的20%～50%,近胸膜部較重;④重度肺泡炎3分:面積大于50%,偶見肺泡腔內有單核細胞及出血造成的實變。2）肺纖維化:①無肺纖維化0分;②輕度肺纖維化1分:受累面積＜20%;③中度肺纖維化2分:受累面積20%～50%;④重度肺纖維化 3分:受累面積＞50%,肺泡結構紊亂。

2 結果

2.1 氣管給藥與腹腔給藥兩種造模方式比較

2.1.1 小鼠生存率比較 BLM注射處置后,P組小鼠無死亡,生存率為100%;而I組小鼠生存率為50%,死亡主要發生在1～10天。兩組間統計學差異顯著（P＜0.05）。

2.1.2 小鼠體重變化 造模后小鼠體重開始下降,以0～6天明顯。P組小鼠體重下降5克,I組小鼠體重下降3克,第6天后模型組小鼠體重變平穩,而I組小鼠體重在14天后逐漸上升。各組小鼠體重標準差比較發現:C組及I組標準差較大,而P組個體間差異較小。以各組小鼠平均體重及標準差作圖如下,見圖1。

2.1.3 小鼠呼吸系統癥狀比較 造模后小鼠出現咳嗽及撓鼻等呼吸障礙表現。每日上午同一時間計數每只小鼠5分鐘內咳嗽及撓鼻次數。統計后發現:C組小鼠無咳嗽及撓鼻,P組癥狀較I組重,模型組癥狀在28天后逐漸減輕,但并未消失。見圖2。

2.1.4 各組小鼠肺系數比較 小鼠處死后依照公式計算肺系數,結果顯示各時間段腹腔給藥方式造模小鼠的肺系數均較氣管給藥組肺系數高。經統計學分析P組與I組40天處死小鼠肺系數之間比較P＜0.05,有明顯統計學差異,其他時間點差異不顯著。提示腹腔給藥方式造模40天時小鼠纖維化程度較氣管給藥組重。見圖3。

2.1.5 肺臟病理變化 腹腔注射法形成的纖維化改變主要分布于胸膜下及血管周圍,氣管滴入法主要分布在支氣管、細支氣管周圍,尤其以近肺門處更為明顯。兩組病理評分與比陰性對照組比較有統計學差異（P＜0.05）,而兩組之間比較差異不顯著。見圖4。

圖1 兩種給藥方式小鼠體重變化Fig.1 Different medicine given way induced the change of m ice'sweight

圖2 癥狀比較Fig.2 Symp tom comparison

圖3 肺系數比較Fig.3 Pulmonary system of different adm ission method

2.2 篩選腹腔給予博萊霉素造模的給藥次數 進一步摸索腹腔注射博萊霉素的給藥次數,選用了24只雄性SPF級ICR體重18～22克小鼠,隨機分為4組 ,于實驗 0、2、4、6、8 天于腹膜腔注射 BLM（40mg/kg）200μl3、4或5次,陰性對照組同時給予同體積生理鹽水。觀察小鼠體重及肺系數變化。

圖4 病理評分比較Fig.4 Comparison of patho-score

圖5 不同給藥次數體重變化比較Fig.5 W eight changeby different adm ission times

圖6 不同給藥次數肺系數變化Fig.6 Pu lmonary system change which were induced by different bleomycin adm ission

2.2.1 體重變化比較 給予BLM后均低于陰性對照組,隨著給藥次數的增加,小鼠體重增加速度明顯減慢,最明顯為給藥5次組。見圖5。

2.2.2 肺系數的變化 于實驗第28及40天處死小鼠,比較各組肺系數。隨給藥次數增加,小鼠肺系數逐漸增高,以給藥5次最高。見圖6。

2.2.3 成模率比較 三種給藥次數小鼠分別于開始造模后28天或40天處死,第40天以5次給藥組小鼠成模率最高,為100%,而4次及3次給藥分別為80%及60%,相比較而言5次給藥成模率更高。

3 討論

BLM是一種細胞毒性抗癌藥物,具有致肺纖維化的副作用,因而常被用來制備肺纖維化動物模型。ICR小鼠腹腔注射BLM 40mg/kg,可形成廣泛的肺間質纖維化[3]。BLM 5mg/kg氣管內注射也是制備這種模型的常用方法。本研究利用ICR小鼠,探討制備肺間質纖維化模型的異同點并比較不同腹腔給藥次數造成小鼠肺間質纖維化病變。結果發現,氣管注射法有較高的死亡率（50%）,小鼠的死亡發生在6～9天,這與其他研究結果相似[3,6]。而腹腔注射在本實驗中未造成小鼠死亡。肺組織病理結果顯示,腹腔注射法形成的纖維化改變主要分布于胸膜下及血管周圍,與Harrison[6]的實驗結果相似。氣管滴入法主要分布在支氣管、細支氣管周圍,尤其以近肺門處更為明顯,這與Ekimoto[8]報道的結果相似。氣管滴入及腹腔注射兩種小鼠肺纖維化改變的分布存在著明顯的不同,這種表現推測與兩種方法注射后,BLM在肺組織局部的分布濃度不同有關。靜脈注射BLM后,可能由于肺門處血流速度較快,而肺外周流速明顯減慢,所以其在肺周邊更容易形成明顯的纖維化病理改變,模型形成晚,需要40天,更接近臨床。而氣管內注射BLM后,藥物經支氣管上皮吸收后,可能在支氣管周圍局部形成BLM濃度較高區域,所以在支氣管周圍特別是臨近肺門處而不是周邊肺組織形成明顯的纖維化改變。比較3種不同腹腔注射博萊霉素次數的小鼠模型,注射5次的小鼠體重及肺系數變化更為明顯,為腹腔注射博萊霉素的更好方式。

在本研究中發現氣管給藥與腹腔給藥均能成模。采用腹腔注射BLM制作小鼠肺纖維化動物模型,操作簡便、快捷、個體間差異小,可以減輕因手術操作熟練程度的不同造成的纖維化程度不同。在操作過程中注意使小鼠處于頭低腳高位,以避免腹腔臟器的副損傷。模型的形成可能與藥量有關,腹腔給藥3次組,體重已有變化,但不足以造成嚴重的病理變化,5次給藥更容易成模。氣管內注射BLM,需麻醉小鼠后手術剖開頸部皮膚,鈍性分離肌肉組織充分暴露氣管,有一定感染及術中副損傷造成小鼠死亡的危險性,盡量減少操作時間、減少組織損傷,有可能減少死亡的風險。

用BLM復制肺纖維化動物模型被認為是最近似于特發性肺間質纖維化（IPF）病理改變的模型[5]。腹腔注射法形成的病變主要分布于胸膜下,接近人類特發性肺間質纖維化的影像學表現,而氣管滴入法主要分布在支氣管、細支氣管周圍,所以腹腔注射法與臨床IPF病理分布更為接近。本研究提示,靜脈和氣管內注射BLM復制肺纖維化動物模型,不僅在肺組織纖維化病理改變的分布上存在差異,而且成模率高,小鼠死亡率低。比較3個不同的腹腔給予博萊霉素的劑量,實驗結果顯示根據對體重、肺系數及成模率比較及對小鼠藥物其他毒性最小,給予BLM 40mg/kg 5次可以更好的復制出小鼠間質性肺疾病的模型,更加適用于科研動物模型的應用。

1 Antoniou KM,AlexandrakisM G.Cytokinenetwork in pathogenesisof idiopathic pulmonary fibrosis[J].Sarcoidosis Vasc Diffuse Lung Dis,2005;22（2）:91-95.

2 Wang Q J,Wang Y J,DallasMetal.Effect of antibody againstinte grin onBleomycin induced pulmonary fibrosis in mice[J].Biochem Pharmae,2000;60（12）:1949-1958.

3 Clark JG,KostalKM,MarinoBA.Bleomycin-induced pulmonary fibrosis in hamsters.An alveolar macrophage product increases fibroblast prostaglandin E2 and cyc lic adenosinemono-phosphate and suppresses fibroblast proliferation and collagen production[J].JClin Invest,1983;72（6）:2082-2091.

4 GharaeeM,UllenbruchM,Phan SH.Animalmodelsofpulmonary fibrosis[J].Methods: MolMed,2005;117:251-259.

5 Felix C,Jack G,Geoffrey J.Pulmonary fibrosis searching formodel answers[J].Am JRespir CellMol Biol,2005;33:9-13.

6 Denis J,Schrier D,Robin Getal.The role of strain variation in murine Bleomycin-induced pulmonary fibrosis[J].Am Rev Respir Dis,1983;127:63-66.

7 SzapielS V,Elson NA,Fulmer JDetal.Bleomycin-induced interstitial pulmonary disease in the nude,athym icmouse[J].Am Rev Respir Dis,1979;120（4）:893-899.

8 EkimotoH,TakahashiK,Matsuda Aetal.Experimentally induced bleomycin pulmonary toxicity-comparison of the systemic（intraperitoneal）and local（intratracheal）administration[J].Gan To Kagaku Ryoho,1983;10（12）:2550-2557.

[收稿2009-11-01]

（編輯 張曉舟）

Comparison of mouse lung fibrosis induced by intraperitoneal injection and intratracheal instillation of bleomycin

LILi-Na,WANGHua,ZHOULei,ZHANGYong-Sheng,YUYong-Li,WANGLi-Ying,SUNLu-Guo.Departmentof MolecularBiology,NormanBethuneMedicalCollege,JilinUniversity,Changchun130021,China

Objective:To study the differences of bleomycin-induced pu lmonary fibrosis inmice induced by intraperitoneal in jection and intratracheal instillation of bleomycin.Methods:ICRmice（male,8w of age,18 to22 gbodyweight）wereused.①ICRmicewere randomly divided into three groups.In the group P,bleomycin was injected intraperitoneal five times in a dose of 40 mg/kg,and in the group I,bleomycin was instilled intratracheally in a doseof5mg/kg.Themicewere killed at14,28 or40 day.②ICRm icewere randomly divided into fourgroups:bleomycinwas injected intraperitoneal three,fouror five timesin a doseof40mg/kg,and in thegroup control,bleomycinwasinjected intraperitoneal in a dose of 200μl for five times.Themice was killed at28 or 40 day.The pathological changes and symptomswere observed.Results:①Theweightof themice given blemycinewere lostafter injection.Symptomsweremore serious in group P than thoseof group I.The pulmonary coefficient of group Pwasmore than thatofgroup I.At28 day after injection,fibrosiswaswidely and stably formedmainly in around thebronchiaand bronchioles,especially,near the pu lmonary hilararea,in thegroup Imice,however,the same changesweremainly seen under the pleura or perivascular pulmonary tissues in themice of group P.The pathological score of pulmonary fibrosiswas different between those twogroups.②Different dose of bleomycine induced different change of themouse'sweight.Themostof all of the three groupwere five time injection;The lung index of five time injection of bleomycine was themost.The pulmonary fibrosismousemodelwasmade successfully.After comparising all of the data,we found intraperitonealofbleomycine five timeswas themore convenientmethod.Conclusion:The sites of pu lmonary fibrosis in themice are differentbetween themice induced by intraperitoneal injection or intratracheal instillation of bleomycin.Intraperitoneal in jection five times is amore convenientmethod tomake pulmonary fibrosis.

ICRmouse;Bleomycin;Pulmonary fibrosis

R563.1

A

1000-484X（2010）03-0254-04

①吉林大學白求恩醫學院免疫學教研室,長春130021

李麗娜（1976年-）,女,在讀博士,主治醫師,講師,主要從事肺纖維化方面發病機理及治療方面研究。

·臨床免疫學·