SH-2Kd-HBc四聚體的構(gòu)建及其初步的檢測應(yīng)用①

宋 娜 郝友華 楊新星 丁紅暉 楊東亮 （武漢市婦女兒童醫(yī)療保健中心檢驗(yàn)部,武漢 430016）

SH-2Kd-HBc四聚體的構(gòu)建及其初步的檢測應(yīng)用①

宋 娜 郝友華②楊新星②丁紅暉②楊東亮②（武漢市婦女兒童醫(yī)療保健中心檢驗(yàn)部,武漢 430016）

目的:sH-2Kd-HBc復(fù)合物四聚體的構(gòu)建與檢測,為進(jìn)一步檢測抗原特異性T細(xì)胞,探討免疫發(fā)病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。方法:將四個(gè)生物素化的可溶性復(fù)合物單體與熒光標(biāo)記的親和素結(jié)合形成四聚體。采用HBcAg真核表達(dá)質(zhì)粒（pcDNA3-C）通過不同的途徑免疫小鼠,獲得針對(duì)核心抗原的特異性CTL,與制備的四聚體共孵育,結(jié)合流式細(xì)胞儀術(shù)進(jìn)行檢測。結(jié)果:三種免疫方法所得到的細(xì)胞中,抗原特異性CTL頻數(shù)較對(duì)照組都有明顯提高（0.24%,0.26%,0.36%vs 0.07%,P≤0.05）。顯示制備的四聚體能與抗原特異性T細(xì)胞結(jié)合,具有檢測功能。三種不同的免疫途徑所引起的抗原特異性的體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答強(qiáng)度各有不同。與傳統(tǒng)的肌肉注射組相比,基因槍免疫組的體液免疫應(yīng)答水平較弱而細(xì)胞免疫應(yīng)答水平較強(qiáng)。高壓水注射（HDI）組的體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答水平都要明顯高于肌肉注射組結(jié)論:獲得了功能性的sH-2Kd-HBc復(fù)合物四聚體,為進(jìn)一步檢測抗原特異性T細(xì)胞奠定基礎(chǔ)。

sH-2Kd-HBc復(fù)合物四聚體;抗原的特異性CTL;基因免疫;基因槍;高壓水注射

對(duì)抗原特異性的T細(xì)胞的分析一直是細(xì)胞免疫研究領(lǐng)域的重點(diǎn)。1992年,Garboczi等[1]首次成功地在體外構(gòu)建了HLA-A2抗原復(fù)合物,在此基礎(chǔ)上建立的MHC-抗原肽四聚體技術(shù)結(jié)合流式細(xì)胞儀快速、多參數(shù)檢測和分選等功能,不僅能定量檢測抗原特異性T細(xì)胞,還可對(duì)CTL的表面標(biāo)志進(jìn)行鑒定、分選,成為該領(lǐng)域必不可少的工具[2-5]。目前,基因免疫能誘導(dǎo)強(qiáng)的體液免疫以及細(xì)胞免疫應(yīng)答備受研究者關(guān)注[6],而高壓水注射病毒DNA是較為經(jīng)典的有效造成動(dòng)物急性病毒感染的方法之一[7]。本研究在已成功地構(gòu)建及純化生物素化的sH-2Kd-HBc單體的基礎(chǔ)上[8],進(jìn)一步制備出相應(yīng)的針對(duì)HBV核心蛋白HBc131-139aa的四聚體。同時(shí)采用高壓水注射和兩種基因免疫方法在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)強(qiáng)的特異性T細(xì)胞應(yīng)答,利用制備的四聚體檢測特異性CTL的頻數(shù)改變,為深入研究HBV感染過程中特異性CTL應(yīng)答和效應(yīng)機(jī)制提供一定的參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料 生物素化的sH-2Kd-HBc單體以及免疫小鼠的pcDNA3-C質(zhì)粒均由本室構(gòu)建保存[8];結(jié)合熒光染料的親和素（PE-streptavidin）和FITC標(biāo)記抗CD8抗體分別購自eBioscience公司和CALTAG LAB-ORATORIES;Amicon Ultra-15離心超濾管（YM-100.000-UFC901008）購自M illipore公司;基因槍及制作基因槍子彈的材料由BioRad公司提供;ELISA檢測選用科華“立可讀”HBcAb Kit板;羊抗鼠IgG抗體購自井山公司。

1.2 方法

1.2.1 sH-2Kd-HBc復(fù)合物四聚體的形成及純化計(jì)算四聚體化所需的鏈親和素（Streptavidin）的量,分次少量地將藻紅蛋白（PE）標(biāo)記的鏈親和素（PEStreptavidin）加入MHC-peptide單體中,先加入總量的50%,將余量分作10份,每隔20分鐘加入一份,4℃暗室中反應(yīng)過夜。四聚體化后再裝入100 kD MWCO的超濾管中進(jìn)行超濾濃縮,可以去除多余的單體,將體積濃縮至＜500μl,最后用 PBS（PH8.0）將總體積定為15ml。如果需長期儲(chǔ)存,可加入蛋白酶抑制劑,NaAzide,Na2EDTA繼續(xù)超濾濃縮至一定的體積保證濃度約為0.5～2 mg/m l,再轉(zhuǎn)入棕色試劑瓶中,4℃避光保存半年至一年。

1.2.2 免疫BALB/c小鼠獲取抗原特異性CTL 免疫方案見表1。

1.2.3 流式細(xì)胞儀檢測CD8+、tetramer+CTL細(xì)胞收集免疫后小鼠的脾細(xì)胞到尖底離心管,600～1 000 r/min離心5分鐘;棄上清,加RBC裂解液2ml靜置6分鐘后再離心;棄上清,用PBS及無血清的1640各洗滌一次;最后加含血清的1640,稀釋10～20倍后,在計(jì)數(shù)板上計(jì)數(shù),將細(xì)胞濃度調(diào)整至106細(xì)胞/m l,加入到6孔板一部分孔內(nèi)不加刺激物,另一部分孔內(nèi)加肽及m IL-12等刺激物,放入細(xì)胞培養(yǎng)箱。體外刺激5天后收集孔內(nèi)的細(xì)胞,轉(zhuǎn)移到流式專用試管（2×106細(xì)胞/管）,4℃960 r/min離心5～10分鐘,棄上清,加入FACS緩沖液5ml,混勻后再如上條件離心,棄上清,留 50～100μl的FACS緩沖液重懸細(xì)胞,于暗處向重懸液加入tetramer（2～3μg）充分混勻置4℃避光染色 2小時(shí),再加入4μl的FITC-CD8抗體充分混勻置4℃避光染色1小時(shí),FACS緩沖液洗滌2次,最后將細(xì)胞重懸于400μl FACS緩沖液上機(jī)進(jìn)行流式分析。

1.2.4 ELISA檢測小鼠血清抗HBcAg抗體滴度小鼠血清以 1∶50、1∶100、1∶200 、1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200和1∶6 400比例稀釋后加入HBcAb Kit板,37℃孵育1小時(shí),洗孔后各加入100μl稀釋的羊抗鼠IgG抗體,37℃孵育40分鐘,洗板后顯色,測OD值。

2 結(jié)果

2.1 利用制備的四聚體檢測抗原特異性CTL 我們所制備的四聚體選擇的抗原肽表位位于HBV核心區(qū),將HBc的真核表達(dá)質(zhì)粒免疫小鼠獲得的特異性T細(xì)胞中包括針對(duì)選擇的抗原肽表位的CTL,因此能與四聚體結(jié)合而被特異性染色,可通過流式細(xì)胞儀檢測。結(jié)果如圖1,在空質(zhì)粒對(duì)照組中,PE-tetramer和FITC-CD8單抗雙染的陽性細(xì)胞頻率為0.07%,而在肌肉注射組、基因槍組和HDI組中,雙染陽性細(xì)胞的頻率分別為 0.24%、0.26%和0.36%,利用SAS統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)3組雙染的陽性細(xì)胞進(jìn)行 χ2檢驗(yàn)分析,A組和B、C、D組之間的P值均小于0.05,具有顯著差異（見表2）。

2.2 ELISA檢測小鼠血清抗HBc抗體滴度 小鼠血清以 1∶50、1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600 、1∶3 200和1∶6 400比例稀釋后作ELISA檢測。當(dāng)實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照的OD值之比大于2.1時(shí),視為陽性。結(jié)果如圖2顯示,液相高壓注射組和肌肉注射組的抗體滴度至少在1∶3 200以上。其中液相高壓注射組的抗體滴度最高,其次為肌肉注射組,而基因槍免疫組的抗體滴度最低,處于陽性判定的邊緣。

2.3 不同免疫途徑誘導(dǎo)的針對(duì)HBcAg的體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答的比較 小鼠血清以1∶3 200比例稀釋后作ELISA檢測,實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照的OD值之比為縱坐標(biāo)（圖2）。將分離的小鼠脾細(xì)胞用抗原特異性的tetramer檢測,以各實(shí)驗(yàn)組雙陽性細(xì)胞的頻度與對(duì)照組的比值為縱坐標(biāo)（圖3）。結(jié)果顯示三種不同的免疫途徑所引起的抗原特異性的體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答強(qiáng)度各有不同。與傳統(tǒng)的肌肉注射組相比,基因槍免疫組的體液免疫應(yīng)答水平較弱而細(xì)胞免疫應(yīng)答水平較強(qiáng)。HDI組的體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答水平都要明顯高于肌肉注射組。

表1 獲取抗原特異性CTL的免疫方案Tab.1 The immunol scheme of aquiring antigenic specific CTL

圖1 Tetramer流式細(xì)胞術(shù)對(duì)特異性CTL的染色與檢測Fig.1 Determ ination of specific CTL by flow cytometry

表2 3組雙染陽性細(xì)胞的 χ2檢驗(yàn)分析Tab.2 Theχ2-test analysis of specific CTL（double staining positive cells）in 3 groups

圖2 針對(duì)HBcAg的體液免疫應(yīng)答Fig.2 Humoral immunoresponse to HBcAg

圖3 針對(duì)HBcAg的細(xì)胞免疫應(yīng)答Fig.3 Cellu llar immunoresponse to HBcAg

3 討論

T細(xì)胞應(yīng)答的一個(gè)最顯著的特征是針對(duì)特異性抗原肽的T細(xì)胞頻數(shù)的增多,這一反應(yīng)可通過MHC-抗原肽四聚體與TCR的高親和力,同時(shí)結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)多參數(shù)的分析功能,實(shí)現(xiàn)MHC-抗原肽四聚體對(duì)特異性CTL的染色與檢測。許多研究從不同角度證實(shí)MHCⅠ類分子四聚體對(duì)特異性CTL的檢測具有強(qiáng)的抗原特異性與高的敏感性,在免疫學(xué)各個(gè)領(lǐng)域包括感染免疫、腫瘤免疫及自身免疫疾病中廣泛應(yīng)用于分析抗原特異性T細(xì)胞應(yīng)答,改變了我們?cè)葘?duì)T細(xì)胞免疫應(yīng)答的認(rèn)識(shí)[9-11]。

本研究一方面制備出HBV核心蛋白HBc131-139aa的四聚體,另一方面采用三種免疫的方法在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)強(qiáng)的特異性T細(xì)胞應(yīng)答,利用制備的四聚體檢測特異性CTL的頻數(shù)改變,不僅對(duì)四聚體進(jìn)行了功能鑒定,而且通過我們的四聚體對(duì)這三種免疫方法的免疫效果進(jìn)行了比較。

基因免疫又稱DNA免疫或核酸免疫,是將含有編碼抗原基因的重組真核表達(dá)質(zhì)粒直接免疫機(jī)體,使載體上的基因在體內(nèi)持續(xù)表達(dá)出天然抗原物質(zhì),與自然感染相似,表達(dá)的抗原以天然構(gòu)象提呈給宿主免疫系統(tǒng),無抗原表位的改變,不僅能誘導(dǎo)體液免疫,更重要的是產(chǎn)生強(qiáng)有力的細(xì)胞免疫[12]。肌肉注射DNA疫苗后,注射部位的肌細(xì)胞在誘導(dǎo)CTL反應(yīng)中并不起直接和主導(dǎo)作用。而是肌組織內(nèi)的抗原提呈細(xì)胞（APC）直接吞入質(zhì)粒,合成抗原蛋白進(jìn)入MHCⅠ類提呈途徑;或者質(zhì)粒隨血流進(jìn)入外周淋巴器官轉(zhuǎn)染此處的APC;又或者由肌細(xì)胞內(nèi)合成的抗原釋放到細(xì)胞外,通過某種方式傳遞給APC再進(jìn)入提呈途徑[13]。處于再生狀態(tài)的較“年輕”的肌細(xì)胞攝取重組質(zhì)粒的能力高于成熟的肌細(xì)胞,因此用蛇毒（如心肌毒素）或麻醉劑（如鹽酸布比卡因）對(duì)注射部位預(yù)處理,使肌細(xì)胞受損后再進(jìn)入再生狀態(tài),從而更有利有于質(zhì)粒的攝取和表達(dá)[14]。

基因槍法,又稱為“高速微彈法”。是將重組質(zhì)粒包被在金屬微顆粒上（金顆粒或鎢顆粒）,利用高壓加速裝置將顆粒直接轟入受免動(dòng)物的上皮細(xì)胞內(nèi),從而提高了質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染效率,是導(dǎo)入基因疫苗的有效方法[15]。皮膚是機(jī)體與外界直接接觸的門戶,表皮內(nèi)含有提呈抗原功能最好的APC即朗漢氏細(xì)胞。用于基因槍的金屬顆粒直徑在0.5～0.9 μm之間,遠(yuǎn)小于細(xì)胞,經(jīng)加速射出后,有的直接射入到細(xì)胞中,包被其上的質(zhì)粒也一起帶入細(xì)胞中;金屬顆粒射入細(xì)胞間隙后作為異物可誘導(dǎo)皮下APC發(fā)生吞噬作用,增加重組質(zhì)粒進(jìn)入細(xì)胞比例。經(jīng)過免疫組化分析表明[16],基因槍射入局部皮膚細(xì)胞中的重組質(zhì)粒有20%可瞬時(shí)表達(dá)抗原基因,其中1%長期表達(dá)。許多研究表明該接種方法主要傾向于誘導(dǎo)Th2型反應(yīng),即主要激活CD4+Th2類細(xì)胞和分泌IgG1型抗體為主的B細(xì)胞[17]。也有研究發(fā)現(xiàn)通過基因槍既可誘導(dǎo)保護(hù)性的抗體反應(yīng)又能誘導(dǎo)強(qiáng)的特異性CTL應(yīng)答[18]。

利用我們制備的四聚體對(duì)這三種免疫方法誘導(dǎo)特異性CTL應(yīng)答和體液應(yīng)答的效果進(jìn)行了比較,結(jié)果發(fā)現(xiàn)三種方法均能誘導(dǎo)出針對(duì)HBcAg特異性的CTL應(yīng)答和體液應(yīng)答,但是不同的免疫途徑之間存在明顯的差異。肌肉注射質(zhì)粒DNA作為傳統(tǒng)的基因免疫方法能夠較好的誘導(dǎo)抗原特異性的CTL應(yīng)答和體液應(yīng)答。但此方法需要對(duì)注射部位進(jìn)行預(yù)處理,而且每次免疫需要100μg的質(zhì)粒DNA。與之相比,在用基因槍進(jìn)行免疫時(shí),每次只需要1μg的質(zhì)粒DNA就足以激發(fā)機(jī)體免疫應(yīng)答。與報(bào)道不同的是,我們?cè)谟肏BcAg真核表達(dá)質(zhì)粒通過基因槍免疫小鼠后,機(jī)體產(chǎn)生的特異性抗體滴度僅為1∶3 200,明顯低于其他兩組。產(chǎn)生的特異性CTL應(yīng)答則要高于肌肉注射組。而在HDI組中,不論是特異性CTL應(yīng)答還是體液應(yīng)答都要明顯高于前兩組。我們認(rèn)為這一現(xiàn)象出現(xiàn)的原因可能與質(zhì)粒所表達(dá)抗原的類型和APC的類型有關(guān),即不同的抗原能誘導(dǎo)不同類型的應(yīng)答,而同一種抗原經(jīng)不同的APC提呈后也可誘導(dǎo)不同傾向的應(yīng)答。HDI會(huì)導(dǎo)致質(zhì)粒DNA在肝臟中大量表達(dá),基因槍則將質(zhì)粒DNA直接送至皮下。在肌肉、肝臟和皮下表達(dá)的抗原可能分別由不同類群的APC所提呈,最終影響免疫應(yīng)答的傾向。這一過程中的抗原提呈機(jī)制和免疫調(diào)節(jié)機(jī)制是值得我們重視的研究方向。

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[收稿2009-07-25 修回2009-11-17]

（編輯 張曉舟）

Construction and primary application of sH-2Kd-HBc tetramer

SONGNa,HAOYou-Hua,YANGXin-Xing,DINGHong-Hui,YANGDong-Liang.TheClinicalLaboratoryofMedical&HealthCenterforWomenandChildreninWuhan,Wuhan430030,China

Objective:To prepare and test tetrameric sH-2Kd-HBc complex for the furthermeasurementof the specific CTL response.Methods:PE labled streptavidin with 4 biotinylated binding sites can bind to 4 biotinylatedmonomer to form the corresponding tetramer.Mice were immunized via differentmethods of genetic immunization by use of the construted pcDNA3-C plasmid to get the specific CTLs.Then our prepared tetramerwas applied to stain the specific CTLs by the analysis of flow cytometry.Results:We applied our p repared tetramer to stain the cells from the experimentalgroups and controlgroup.The results showed the tetramerwas able to discriminate the frequencies of specific CTL induced by the three immunolmethods（0.24%,0.26%,0.36%vs 0.07%,P≤0.05）.This demonstrated that the prepared tetramer could bind its targets specifically and efficiently.The three immunolmethods induced different levels of immune responses.Compared with the traditionalmuscle injection,gene gun inducedweaker humoral immune response and stronger cellular immune response,and hydrodynamic injection induced the strongest humoral and cellu lar immune responses.Conclusion:Have successfully constructed the sH-2Kd-HBc tetramer.The techniques andmethods can be used for preparation of tetramers of other types ofMHCⅠmolecules.

sH-2Kd-HBc complex tetramer;Antigenic specific CTL;Genetic immunization;Genegun;Hydrodynam ic injection

R392.33

A

1000-484X（2010）03-0245-05

①本文為國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃（973計(jì)劃）（No.20014CB510008）②華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院臨床免疫室,武漢 430030

宋 娜（1979年-）,女,碩士,醫(yī)師,主要從事臨床免疫學(xué)研究,E-mail:songna596@126.com;

及指導(dǎo)教師:楊東亮（1955年-）,男,教授,主任醫(yī)師,博士生導(dǎo)師,主要從事病毒性傳染病的基礎(chǔ)研究和臨床工作,E-mail:dlyang@tjh.tjmu.edu.cn。