龍牙木多糖誘導人肝癌SMMC-7721細胞凋亡機制研究①

王麗君 石莉萍 （北華大學化學與生物學院,吉林 132013）

王麗君 石莉萍 （北華大學化學與生物學院,吉林 132013）

目的:探討龍牙木多糖（AEPS）對體外培養人肝癌SMMC-7721細胞凋亡的影響,并探討其可能的作用機制。方法:熒光顯微鏡觀察細胞形態學變化,流式細胞術（FCM）檢測SMMC-7721細胞的凋亡率;Western blot檢測不同濃度AEPS作用36小時凋亡蛋白 survivin、caspase-3及bcl-2的表達情況。結果:與對照組比較,AEPS不同濃度劑量組Hoechst33258/PI熒光染色出現典型的凋亡形態學改變;FCM檢測表明SMMC-7721細胞凋亡率各實驗組均明顯高于對照組（P＜0.01）,且呈時間劑量依賴性;Western blot顯示與對照組相比,各實驗組AEPS可顯著下調SMMC-7721細胞 survivin和bcl-2的表達（P＜0.01）,而caspase-3的表達顯著增加（P＜0.01）。結論:AEPS能明顯誘導人肝癌SMMC-7721細胞凋亡,其機制可能與改變凋亡相關基因survivin、caspase-3及bcl-2的表達有關。

龍牙木多糖;凋亡;survivin;caspase-3;bcl-2

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器 AEPS（純度96.83%）由本實驗室制備,SMMC-7721肝癌細胞（中國科學院上海細胞生物學研究所）,DMEM培養基（美國Gibco BRL公司）,胎牛血清（杭州四季青生物工程有限公司）,碘化丙啶（PI）（美國 Caltag公司）,β-actin、bcl-2,survivin、caspase-3抗體（Santa Cruz Biotechnologies公司）,流式細胞儀（FCM）（美國Beckman coulter公司）,Annexin/PI凋亡檢測試劑盒（北京寶賽公司）,Hoechst33258/PI熒光染色試劑盒（美國Sigma公司）,BX51TF熒光顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 SMMC-7721肝癌細胞株培養在10%胎牛血清的DMEM培養基（含100 U/m l青霉素和100 U/m l鏈霉素）中,于37℃、5%CO2的細胞培養箱中培養,用0.25%的胰酶消化傳代,取對數生長期細胞進行實驗。

1.2.2 熒光顯微鏡觀察SMMC-7721肝癌細胞凋亡將1×106細胞接種于6孔細胞培養板中,培養24小時后,分別加入 50、100、200 μg/ml的 AEPS,同時設對照組,48小時后行常規細胞涂片,固定,Hoechst33258/PI染色后封固,熒光顯微鏡下觀察,記錄細胞形態變化情況,拍照。

1.2.3 Annexin V-FITC/PI雙染法流式細胞儀檢測細胞凋亡 選取對數生長期細胞接種于24孔板中,加入AEPS使其終濃度分別為50μg/m l（低劑量組）、100μg/m l（中劑量組）、200 μg/ml（高劑量組）,處理細胞12、24、36、48 小時后,用0.25%胰酶+0.02%EDTA消化,計數后取約5×105個細胞,1 000 r/min離心5分鐘后棄上清液,用預冷PBS洗滌2次,按試劑盒說明書加入Annexin V-FITC 10μl和PI 5μl,避光室溫反應15分鐘,在1小時內用流式細胞儀檢測凋亡細胞比率。使用CellQuest軟件獲取細胞信息,Winmdi軟件分析細胞凋亡。實驗重復3次,另設空白對照組。

1.2.4 Western blot檢測 survivin、caspase-3和bcl-2蛋白表達 應用Western blot技術,以β-actin作為內照物,比較各組 survivin、caspase-3和bcl-2蛋白表達水平的改變。作用36小時后分別收集空白對照組、AEPS 50、100、200μg/ml劑量組的細胞,PBS洗3次,加入預冷的細胞裂解液,裂解后離心取上清,用Bradford法測定各種蛋白的濃度。分別取蛋白樣品,按體積比4∶1加入上樣緩沖液,100℃、5分鐘變性,經SDS-PAGE（5%的濃縮膠,18%的分離膠）電泳分離后,將蛋白電轉印于硝酸纖維素膜經脫脂奶粉封閉液封閉,將硝酸纖維素膜分別加入稀釋后一抗,再用相應辣根過氧化物酶（HPR）標記的二抗稀釋液孵育,用 ECL發光法檢測不同樣品各種蛋白表達狀況。圖像以Bio-Rad圖像分析系統分析,用目的蛋白條帶的平均光強度值與β-actin條帶的平均光強度值的比值表示該蛋白表達的相對強度。

2 結果

2.1 Hoechst33258/PI雙染法觀察細胞凋亡形態學改變 AEPS 50、100、200 μg/m l處理SMMC-7721 細胞48小時,Hoechst 33258/PI熒光染色結果見圖1。不同濃度AEPS處理SMMC-7721細胞48小時后,出現典型的凋亡形態學改變。染色質分布均勻的藍色細胞為正常細胞。細胞核染色質凝集、分布不均、產生強烈熒光為凋亡細胞,染成紅藍色為晚期凋亡細胞,染成紅色熒光為壞死細胞。50、100、200μg/m l處理過的凋亡率均顯著高于對照組,但壞死率也高于對照組。

2.2 FCM檢測AEPS對SMMC-7721細胞凋亡率的影響 各組細胞在AEPS作用12小時后即出現凋亡現象（圖2）,低、中、高劑量組凋亡率分別為（10.14±0.91）%、（12.32±1.50）%和（14.53±1.97）%,與空白對照組細胞（5.31±0.65）%比較,差異有統計學意義（P＜0.01）;其余時間點各組比較,AEPS處理組凋亡率均高于對照組,差異有統計學意義（P＜0.01）;另外,隨著時間的延長,細胞凋亡的現象越來越明顯,同時在同一時間點隨著AEPS濃度增加,細胞凋亡率亦增加,呈現明顯的劑量/時間正向依賴關系（圖3）。

圖1 熒光顯微鏡觀察SMMC-7721肝癌細胞凋亡（×400）Fig.1 The apop tosis of SMMC-7721 cells were observed by the fluorescentm icroscope（×400）

圖2 SMMC-7721細胞經不同濃度AEPS處理12小時后凋亡情況Fig.2 Apoptosis rate in SMMC-7721 cells after treatment with various concentrations of AEPS for 12 h

圖4 AEPS對 SMMC-7721細胞 survivin、caspase-3及bcl-2蛋白表達的影響Fig.4 The expression levels of survivin,caspase-3 and bcl-2 in SMMC-7721 cells after treatment with various concentrations of AEPS

圖3 SMMC-7721細胞經不同濃度AEPS處理后凋亡情況Fig.3 Apoptosis rate in SMMC-7721 cells after treatment with various concentrations of AEPS

2.3 AEPS對SMMC-7721細胞survivin、caspase-3及bcl-2蛋白表達的影響 Western blot檢測顯示經50、100、200μg/ml AEPS處理SMMC-7721細胞36小時,結果見圖4A。蛋白條帶相對強度圖表明（圖4B）,不同濃度的AEPS作用SMMC-7721細胞后,survivin和bcl-2的蛋白表達均呈現下調的趨勢,200μg/m l AEPS作用SMMC-7721細胞幾乎完全抑制survivin的表達,而caspase-3的表達卻顯著升高,其效應均具有濃度梯度依賴性。

3 討論

腫瘤的發生是一個多基因、多步驟、多階段的復雜過程,細胞凋亡在腫瘤的發生發展中主要起負調控作用[4]。細胞凋亡受抑是腫瘤的發病機制之一,細胞凋亡的失衡導致腫瘤發生并影響腫瘤的生物學行為[5,6]。首先,本研究檢測了AEPS處理SMMC-7721細胞后的凋亡情況,結果顯示與對照組比較,AEPS不同濃度劑量組Hoechst33258/PI熒光染色出現典型的凋亡形態學改變;FCM檢測表明AEPS處理細胞12小時后,SMMC-7721細胞即出現凋亡現象,且存在劑量、時間效應關系。由此推測誘導細胞凋亡是AEPS抗腫瘤作用機制之一。

survivin是新發現的一種凋亡抑制蛋白家族成員,也是迄今發現的最強的凋亡抑制因子,survivin的過度表達抑制了細胞凋亡,有利于細胞的異常增殖和惡性轉化。caspase-3是caspase家族中重要的凋亡執行者之一,抑制caspase-3的活性或拮抗其功能可使細胞凋亡受抑。功能強大的凋亡抑制基因survivin主要在凋亡通路的下游抑制caspase-3發揮抗凋亡的效應[7]。為此,我們采用Western blot檢測了相關凋亡蛋白survivin和 caspase-3的表達情況。結果顯示抑制凋亡蛋白survivin在AEPS誘導下出現了表達顯著下調,而致凋亡蛋白caspase-3的表達顯著增加,從而導致SMMC-7721細胞凋亡。

bcl-2蛋白的功能是阻遏細胞凋亡,并能協助細胞抵抗免疫系統的監視作用,最終導致腫瘤的形成,其過度表達已被證實存在于多種腫瘤組織中。本研究結果表明AEPS可顯著下調SMMC-7721細胞bcl-2的表達（P＜0.01）,提示AEPS誘導SMMC-7721細胞凋亡還可能與bcl-2的表達下調有關。

caspase家族是細胞凋亡中發揮關鍵作用的酶,許多凋亡誘導劑可通過 caspases依賴的方式誘導。Survivin家族凋亡相關基因通過調節線粒體途徑影響凋亡的發生,survivin可直接與 caspase-3、caspase-7結合并抑制它們的活性[8,9]。bcl-2家族成員與線粒體膜通透性相關并調結膜的完整性[10]。本研究中AEPS誘導的SMMC-7721細胞凋亡,一方面可能與下調survivin和bcl-2表達有關,另一方面還可能通過增加caspase-3的表達。這些研究結果提示,線粒體途徑可能是AEPS誘導SMMC-7721細胞凋亡的主要機制之一。

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3 姜建芳,王思平,何新軍.中藥多糖抗腫瘤作用研究進展[J].中國現代應用藥學雜志,2008;25（7）:616-618.

4 Mitza A,M cGuirkM,Hockenberry TNetal.Human survivin isnegatively regulated by wild-type p53 and participates in p53-depend apoptotic pathway[J].Oncogene,2002;21（17）:2613-2622.

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10 Adams JM,Cory S.The Bcl-2 protein fam ily:arbiters of cell survival[J].Science,1998;281:1322-1326.

[收稿2010-08-27]

（編輯 張曉舟）

AEPS induces apoptosis in SMMC-7721 hepatocellular cancer cells and itsmechanism

WANGLi-Jun,SHILi-Ping.CollegeofChemistryandBiology,BeihuaUniversity,Jilin132013,China

Objective:To study themechanism of apoptosis induced by AEPS in SMMC-7721 hepatocellular cancer cells.Methods:The fluorescentmicroscopewas utilized to observe themorphological changes of apoptosis,apoptosis rate were detected with flow cytometry.Western b lot was utilized to detect the expression of survivin,caspase-3 and bcl-2.Results:Typicalmorphological changes of apoptosis in SMMC-7721 cancer cells could be observed by the fluorescencemicroscope.Compared with thatof the control cells,apoptotic rate of the cells treatedwith AEPSwas increased signifcantly（P＜0.01）and ina dose-and time-dependentmanner.Western blot showed thatsurvivin and bcl-2 expressionwas signifcantly decreased（P＜0.01）,whereas caspase-3 expressionwas signifcantly increased（P＜0.01）in SMMC-7721 cancer cells treated with AEPS.Conclusion:AEPS can markedly induce apoptosis in SMMC-7721 hepatocellular cancer cells.The mechanism might be related to the change of survivin,caspase-3 and bcl-2 exp ression.

Polysaccharide ofAraliaelataSeem（AEPS）;Apoptosis;survivin;caspase-3;bcl-2

R735.7 R392.1 R730.1

A

1000-484X（2010）12-1082-04

10.3969/j.issn.1000-484X.2010.12.006

①本文為吉林省科技廳資助項目（20080913）

王麗君（1964年-）,女,碩士,教授,主要從事天然藥物化學成分及生物活性的研究,E-mail:lijun0926@163.com。