脂質體介導的IDO基因轉染未成熟樹突狀細胞對其成熟性及功能的影響①

廖 偉 安曉靜 錢桂生 趙聰敏 （第三軍醫大學新橋醫院兒科,重慶 400037）

脂質體介導的IDO基因轉染未成熟樹突狀細胞對其成熟性及功能的影響①

廖 偉 安曉靜②錢桂生②趙聰敏 （第三軍醫大學新橋醫院兒科,重慶 400037）

目的:探討脂質體介導的IDO基因轉染對未成熟樹突狀細胞（Immature dendritic cells,imDCs）的成熟性及功能的影響。方法:從BALB/c小鼠骨髓培養imDCs,形態學觀察后用流式細胞術鑒定imDC后,將其分為IDO+-imDC組:重組pEGFPN1-IDO質粒在脂質體介導下轉染imDCs;IDO--imDC組:pEGFP-N1空質粒轉染imDCs;imDCs組:imDCs不做特殊處理;mDC組:將培養的imDC用TNF-α誘導成熟。流式細胞術檢測IDO基因轉染im DC細胞后細胞表型是否發生變化。Western b lot檢測各組IDO蛋白表達?；旌狭馨图毎磻獧z測各組在體外刺激T淋巴細胞增殖的能力。結果:BALB/c小鼠骨髓培養的細胞表面標志和細胞形態符合imDCs典型特征;Western blot結果顯示IDO+-imDC組可見IDO蛋白表達;IDO+-imDC組細胞表面分子CD80、CD86、MHCⅡ表達率分別為（9.4±2.2）%、（8.7±1.1）%、（11.4±2.6）%,imDC 組分別為（8.5±1.8）%、（7.5±1.6）%、（10.2±2.1）%,兩組比較無顯著差異（P均＞0.05）,IDO+-imDC組在體外刺激T淋巴細胞增殖的能力明顯低于imDC組（678±90.3vs1 199±275.5,P＜0.01）。結論:脂質體介導的IDO基因轉染imDCs能維持細胞于未成熟狀態,在MLR中,對T細胞增殖有明顯的抑制作用。

吲哚胺2,3-雙加氧酶;樹突細胞;脂質體;轉染

吲哚胺2,3-雙加氧酶（IDO）是色氨酸沿犬尿酸途徑分解代謝的限速酶,而色氨酸是T細胞活化增殖過程中合成蛋白質所必需的氨基酸。已證實在小鼠體內表達IDO的抗原提呈細胞（Antigen presenting cell,APC）在局部組織微環境通過耗竭色氨酸而阻斷T細胞周期使活化的T細胞凋亡,誘導抗原特異性T細胞耐受[1]。同時新近研究表明,未成熟樹突狀細胞（Immature dendritic cells,imDCs）通過刺激初始型T細胞分化成調節性T細胞（Treg）產生誘導免疫耐受形成[2,3]。因此本研究以脂質體介導IDO基因轉染imDCs,觀察IDO表達及imDCs成熟性及功能的變化,以便為同時應用IDO及imDCs來誘導氣道的免疫耐受防治過敏性哮喘提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與材料 含小鼠IDO基因的pEGFPN1-IDO重組質粒由本實驗室構建;rmGM-CSF、rmTNF-α及 rmIL-4（Peprotech公司）;脂質體 DOTAP（Roche 公司）;FITC-MHC Ⅱ、FITC-CD80、FITC-CD86、PE-CD11c單克隆抗體（eBioscience公司）;抗IDO抗體（SantaCruz公司）;Western blot試劑盒、淋巴細胞分離液及HRP標記的羊抗兔IgG（北京鼎國公司）。

1.2 小鼠骨髓來源imDCs的分離、培養 參照文獻[4]進行,頸椎脫臼法處死BALB/c小鼠,用皮試針抽吸 RPMI1640培養液沖洗髓腔,獲得細胞懸液,2 500 r/min×25分鐘離心,調整細胞濃度至2×106m l-1,接種于含10%胎牛血清的RPMI1640培養液中,內含rmGM-CSF（10 ng/m l）及 rm IL-4（10 ng/ml）,37℃、5%CO2培養,以后隔天半量換液,共培養6～8天,去除懸浮細胞,輕輕吹打,收集殘余貼壁細胞即為imDCs。

1.3 細胞形態學觀察及表型鑒定 （1）掃描電鏡觀察:收集培養細胞,調整細胞濃度至1×106m l-1,PBS漂洗、甩干,2.5%戊二醛固定,掃描電鏡觀察并拍照。（2）透射電鏡觀察:收集約1×107個培養細胞離心,加入2.5%戊二醛固定液,1小時后棄去戊二醛,1%鋨酸固定,常規脫水、包埋、切片,鈾鉛雙染色,透射電鏡觀察并拍照。（3）細胞表型鑒定:收集培養的0.5×106～1×106細胞重懸于100μl PBS,每管加入PE-CD11c抗體0.5μl,再分別加入FITC-MHCⅡ、FITC-CD80、FITC-CD86各0.5μl,設空白對照管,4℃放置30分鐘,然后加入PBS,2 000 r/min洗滌3次,重懸于0.4m l PBS中,上機分析,用流式細胞儀檢測細胞表面標志CD11c、MHCⅡ、CD80和CD86的表達。

1.4 細胞處理及分組 將imDCs分為 IDO+-imDC組、IDO--imDC組、imDC組及 mDC組。IDO+-imDC組:用pEGFP-N1-IDO重組質粒轉染培養的imDCs,方法如下:將pEGFP-N1-IDO質粒-HBS混合液50μl（含重組質粒5μg）與100μl DOTAP脂質體-HBS（含30μl DOTAP脂質體）混勻,加入2m l無血清的RPM I1640培養基中,再加入imDCs生長（70%融合）的培養瓶中,37℃、5%CO2培養8小時,更換含10%小牛血清的培養基繼續培養24小時后,用G418選擇性培養基篩選;IDO--imDC組:用脂質體介導pEGFP-N1質粒轉染;mDC 組:加入TNF-α50μg/L繼續培養3天;對照組:細胞不作特殊處理。

1.5 各組細胞表型鑒定 取IDO+-imDC組、imDC組及mDC組行細胞表型鑒定,方法同1.3。

1.6 Western blot檢測IDO蛋白表達 將轉染組細胞裂解,提取蛋白,按Western blot檢測試劑盒說明書操作進行。一抗為兔抗小鼠IDO抗體,二抗為辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG抗體。

1.7 OVA致敏小鼠脾臟CD4+T細胞的分離 OVA致敏小鼠模型的建立:BALB/c小鼠分別于第0、5、10天腹腔內注射抗原混懸液1 ml（含OVA 1mg、氫氧化鋁 200μg）致敏,第 24、25、26天鼻腔內滴入OVA抗原100μg激發。無菌條件下制備致敏小鼠脾細胞懸液,參照小鼠CD4+T細胞分離柱說明書進行CD4+T細胞分離。

1.8 混合淋巴細胞反應（MLR） 無菌條件下制備BALB/c小鼠脾臟細胞懸液,用尼龍毛法獲得T淋巴細胞作為效應細胞,刺激細胞分別為imDC、IDO+-imDC、IDO-imDC及 imDC,另取BALB/c小鼠T淋巴細胞為對照組上述五組細胞均經絲裂霉素C滅活,將效應細胞分別與各組刺激細胞以10∶1比例混合培養于96孔板,每組設3個復孔,37℃、5%CO2條件下培養96小時,加入3H-TdR 37 kBq,繼續培養24小時,收集細胞,β-液閃計數儀檢測每分閃爍計數（cpm）值,各組結果以3孔均值表示。計算各組刺激指數（SI）=實驗組CPM均值/對照組CPM值。

2 結果

2.1 imDCs形態學觀察及表面分子表達 培養24小時后見細胞開始貼壁,4天后懸浮細胞增多,呈簇狀生長,有毛刺狀突起。掃描電鏡觀察顯示,未成熟DC表面多皺褶,有大量的不規則突起,透射電鏡觀察顯示DC內出現大量吞噬小泡,見圖1。符合imDCs形態學特點。流式細胞技術檢測結果示CD11c高表達（72.1%）,CD80（8.5%）、CD86（7.5%）及MHCⅡ（10.2%）呈低水平表達,符合imDCs型特征。

2.2 IDO蛋白表達 Western blot結果表明:轉染組可見一相對分子質量約為42 kD的條帶,免疫印跡證實為IDO蛋白,而空質粒組及對照組未見目的條帶,提示pEGFP-N1-IDO重組質粒轉染imDCs后,imDCs能表達IDO蛋白,見圖2。

圖1 imDCs形態學觀察Fig.1 Morphology and m icrostructure of immature DC

圖2 各組IDO蛋白表達Fig.2 IDO p rotein expression detected by Western b lot in each group

表1 各組DCs表面分子表達率比較（%,±s）Tab.1 Compared the expression of surfacemolecules of DCs in each group（%,±s）

表1 各組DCs表面分子表達率比較（%,±s）Tab.1 Compared the expression of surfacemolecules of DCs in each group（%,±s）

Noge:1）P＞0.05 vs imDC group;2）P＜0.05 vs imDC group.

Groups n CD80 CD86 MHCⅡimDC group 3 8.5±1.8 7.5±1.6 10.2±2.1 IDO+-imDC group 3 9.4±2.21） 8.7±1.11） 11.4±2.61）mDC group 3 65.2±8.92）72.1±9.62） 80.5±7.82）

2.3 imDCs表型分析 IDO+-imDC組的CD11c表達為（79.5±12.6）%,CD80、CD86、MHC Ⅱ仍低表達,分別為（9.4±2.2）%、（8.7±1.1）%、（11.4±2.6）%,與imDC組比較,兩組無顯著差異（P＞0.05）;與mDC組比較,CD80、CD86、MHCⅡ兩組表達有顯著差異（P＜0.05）,說明脂質體介導pEGFP-N1-IDO真核表達載體轉染對未成熟DC成熟性無影響,見表1。

2.4 MLR結果 imDC組的cpm值與對照組比較,無顯著差異（P＞0.05）,只能微弱刺激T淋巴細胞增殖;mDC組cpm值明顯增加,與對照組比較,有顯著差異（P＜0.05）,能明顯刺激T淋巴細胞增殖。IDO+-imDC組與imDC組及對照組比較cpm值及SI均明顯降低比較,有顯著差異（P＜0.05）,說明IDO基因轉染的imDC對T淋巴細胞增殖有明顯的抑制作用,見表2。

3 討論

DC是最有效的APC,它不僅參與抗原的攝取及提呈,誘導免疫反應,而且可誘導免疫耐受。DC駕御免疫反應的方向和程度,目前認為與所處的成熟狀態有關,成熟樹突狀細胞（Mature dendritic cells,mDC）能刺激免疫應答,而imDC因其表面缺乏MHCⅠ/Ⅱ類分子及低表達協同刺激分子,不能激活T細胞產生免疫反應,誘導免疫耐受[5]。Mahnke等[2]研究表明,imDCs通過膜上的DEC-205受體介導內吞作用而攝取外來抗原仍能保持其未成熟狀態,并刺激初始型T細胞分化成CD4+CD25+調節性T細胞（CD4+CD25+Treg）生成,誘導免疫耐受。同時Megan等[3]證實人外周血初始型（naive）T細胞在負載抗原的異源 imDCs刺激下也可向Tr1轉化（Treg的一種）。因此imDCs在免疫耐受中有重要的作用。

表2 各組DC在混合淋巴細胞反應中對小鼠T細胞的刺激作用（±s）Tab.2 The effects of T cell stimulation in m ixed lymphocyte reaction induced by different groups of DCs（±s）

表2 各組DC在混合淋巴細胞反應中對小鼠T細胞的刺激作用（±s）Tab.2 The effects of T cell stimulation in m ixed lymphocyte reaction induced by different groups of DCs（±s）

Note:1）P＜0.05 vs imDC group;2）P＜0.05 vs controlgroup;3）P＞0.05 vs controlgroup.

Groups n MLR（cpm） SI Controlgroup 3 1 290±205.4 —imDC group 3 1 199±275.53） 0.93 IDO--imDC group 3 1 238±320.6 0.96 IDO+-imDC group 3 678±90.31）2） 0.52 mDC group 3 6 560±621.2 5.05

IDO是色氨酸沿犬尿酸途徑分解代謝的限速酶,能催化色氨酸氧化分解成犬尿酸等代謝產物。研究表明T細胞生長微環境中如果無外源色氨酸,被抗原提呈細胞提呈的抗原激活后,因不能合成足夠的蛋白質而停滯于G1期,更易于經凋亡而死亡。IDO在機體免疫豁免器官大量表達,其在保護胎兒免遭母體排斥的妊娠過程、器官移植及自身免疫性疾病耐受中的作用已成為近年研究的熱點,在過敏性哮喘中的免疫耐受中亦引起人們重視[6,7]。已有的研究表明表達IDO的DC能通過以下機制誘導外周免疫耐受:（1）IDO分解代謝局部微環境中的色氨酸而抑制激活T細胞分化、增殖,導致T細胞無能（Treg樣反應）[8]。（2）通過IDO催化色氨酸分解代謝的產物,誘導T細胞凋亡,從而清除活化的抗原特異性T細胞克隆[9]。同時,Taher等[10]在大鼠體內模型中證實通過IDO分解代謝色氨酸分解代謝的產物犬尿酸等在Th2介導的過敏性氣道炎癥可誘導免疫耐受。

過敏性哮喘患者體內能檢測到活化的T淋巴細胞凋亡不足,可能是哮喘發病機制存在著免疫耐受機制缺陷的證據。鑒于初始型（na?ve）CD4+T細胞激活是其發病的始動因素,而且CD4+T細胞在哮喘發生發展過程中起重要作用,因此我們設想通過應用脂質體介導IDO修飾imDCs移入動物模型氣道,imDCs在提呈抗原激活記憶性CD4+T細胞同時表達IDO,抑制活化的CD4+T細胞增殖,將可能誘導氣道抗原特異性T細胞耐受,起到防治哮喘作用。欲達到上述目的,首先要將IDO基因轉染到imDCs分泌表達IDO,同時不能改變其未成熟特性。目前最常用的腺病毒載體,本身有激活imDCs的可能[11]。

與腺病毒載體相比,脂質體載體本身對細胞無毒性。本項目用脂質體轉移系統將IDO基因轉染大鼠imDCs,觀察到DC仍保持未成熟狀態,與王永權等[12]的結論一致,避免了常用的腺病毒載體對imDCs成熟性的影響。同時在混合淋巴細胞反應中,轉染了IDO基因的imDCs能明顯地抑制T細胞的增殖,推測機制可能除了imDCS誘導的免疫抑制作用外,同時imDCs分泌表達的IDO分解代謝色氨酸,從而抑制了T細胞活化并誘導其凋亡有關。以上實驗為我們同時應用IDO及imDCs誘導氣道免疫耐受來防治過敏性哮喘提供了依據。但如何在體內避免其他炎性因子及抗原對 imDCs成熟性的影響,保持imDCs未成熟狀態,起到imDCs與IDO的雙重誘導氣道免疫耐受作用來防治過敏性哮喘還有待繼續深入研究。

1 Munn DH,Sharma M D,Lee JRetal.Potential regulatory function of human dendritic cells expressing indoleam ine 2,3-dioxygenase[J].Science,2002;297（5588）:1867-1870.

2 Mahnke K,Qian Y,Knop Jetal.InductionofCD4+/CD25+regulatory T cellsby targeting of antigens to immature dendritic cells[J].Blood,2003;101（12）:4862-4869.

3 Megan K L,Silvia G,Eleonora Tetal.Differentiation of Tr1 cells by immaturedendritic cells requires IL-10 but not CD25+CD4+Tr cells[J].Blood,2005;105（3）:1162-1169.

4 丁英俊,程 翔,廖玉華etal.大鼠未成熟樹突狀細胞體外分離、擴增與鑒定[J].免疫學雜志,2008;24（4）:249-251.

5 Zhang M,Wang Q,Liu Yetal.Effective induction of immune tolerance by portal venous infusion with IL-10 gene-modified immature dendritic cells leading to prolongation of allograft survival[J].JMolMed,2004;82（4）:240-249.

6 Tan PH,Bharath A K.Manipulation of indoleamine 2,3 dioxygenase;a novel therapeutic target for treatment of diseases[J].Expert Opin Ther Targets,2009;13（8）:987-1012.

7 Le A V,Broide DH.Indoleamine-2,3-dioxygenasemodulation of allergic immune responses[J].Curr Allergy Asthma Rep,2006;6（1）:27-31.

8 Tan PH,BeutelspacherSC,WangYHetal.Immunolipoplexes:An efficient,nonviralalternative for transfectionofhumandendritic cellswith potential for clinical vaccination[J].Mol Ther,2005;11（5）:790-800.

9 Tan PH,Bharath A K.Manipulation of indoleam ine 2,3 dioxygenase;a novel therapeutic target for treatment of diseases[J].Expert Opin Biol Ther,2008;8（11）:1705-1719.

10 Taher Y A,Piavaux B J,Gras Retal.Indoleam ine,3-dioxygenase-dependent tryptophan metabolites contribute to tolerance induction during allergen immunotherapy in amousemodel[J].JA llergy Clin Immunol,2008;121（4）:983-999.

11 Tan PH,Beutelspacher SC,XueSAetal.Modulation of human dendritic-cell function following transduction with viral vectors:implications for gene therapy[J].Blood,2005;105（10）:3824-3832.

12 王永權,彭毅志,王 強etal.脂質體介導的基因轉染對人未成熟樹突狀細胞成熟特性的影響[J].中華燒傷雜志,2006;22（3）:203-206.

[收稿2010-05-27 修回2010-07-19]

（編輯 張曉舟）

Thematuration characteristics and function of immature dendritic cells transfected by liposome-mediated indoleam ine 2,3-dioxygenase（IDO）gene

LIAOWei,ANXiao-Jing,QIANGui-Sheng,ZHAOCong-Min.DepartmentofPediatricsXinqiaoHospital,ThirdMilitary MedicalUniversity,Chongqing400037,China

Objective:To investigate the influence of indoleam ine 2,3-dioxygenase（IDO）genemediated by liposome transfection on function of immature dendritic cells（imDCs）.Methods:ImDCswere cultured from bonemarrow of BALB/cmouse.The cellswere identified by transmission electronm icroscope,scanning electronmicroscope,and flow cytometry.Then the imDCswere divided intoIDO+-imDC group（imDCs transfectedwith recombinant pEGFP-N1-IDO expression vector）,IDO--imDC group（imDCswere transfected with recombinant pEGFP-N1 vector）,control group（imDCswithout special processing）andm DC group（（imDCs inducedwith TNF-α）.IDO protein expression in each group was detected byWestern blot;The expression of cellmarkerwas determined with flow cytometry.Their ability to stimulate antigen-specificity T lymphocyte proliferation was determined with allogeneticmixed leukocyte reaction in each groups.Results:The cultured imDCs of BALB/c mouse bonemarrow exhibited typial characteristics of surfacemarkers and cellmorphology consistentwith imDCs;IDO protein exp ression was seen in transfection group.The expression rate of CD80,CD86,MHCⅡ was（9.4±2.2）%,（8.7±1.1）%and（11.4±2.6）%,respectively,whichwas exhibited no difference compared with those in imDC group（8.5±1.8）%,（7.5±1.6）%and（10.2±2.1）%,respectively,P＞0.01.The ability of IDO+-imDCgroup to stimulate antigen-specificity T lymphocyte p roliferation in vitrowas distinctly lower than in imDC group（678±90.3vs1 199±275.5,P＜0.01）.Conclusion:ImDCs transfected by liposome-mediated IDO gene remain their immature state and can inhibit the proliferation of the T lymphocytes.

Indoleamine2,3-dioxygenase;Dend ritic cells;Liposomes;Transfection

R392.9

A

1000-484X（2010）12-1069-04

10.3969/j.issn.1000-484X.2010.12.003

①本文受國家自然科學基金資助（No.30500231）

②第三軍醫大學新橋醫院全軍呼吸研究所,重慶400037

廖 偉（1971年-）,男,博士,副教授,副主任醫師,主要從事哮喘發病的免疫機制研究,E-mail:liaowei01@163.com;

及指導教師:錢桂生（1954年-）,男,教授,主任醫師,主要從事呼吸窘迫綜合征發病機制研究,E-mail:qianguisheng@163.com。