實驗性自身免疫性腦脊髓炎小鼠發病高峰期外周及中樞淋巴細胞亞群的變化①

席娜娜 鄭榮遠 尚曉峰 王 潭 呂 錦 徐 德 吳正剛 陳國錢

（溫州醫學院附屬第一醫院神經內科,溫州 325000）

實驗性自身免疫性腦脊髓炎小鼠發病高峰期外周及中樞淋巴細胞亞群的變化①

席娜娜 鄭榮遠 尚曉峰 王 潭 呂 錦 徐 德 吳正剛 陳國錢

（溫州醫學院附屬第一醫院神經內科,溫州 325000）

目的:觀察髓鞘少突膠質細胞糖蛋白MOG35-55誘導的實驗性自身免疫性腦脊髓炎小鼠發病高峰期中樞及外周淋巴細胞亞群的變化,探討EAE發病高峰期細胞與體液免疫學的變化。方法:用MOG35-55免疫誘導雌性C57BL/6小鼠制作EAE模型,記錄小鼠行為學變化,HE染色觀察CNS炎癥組織病理變化,使用流式細胞儀檢測小鼠中樞及外周脾臟淋巴細胞中CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD4+CD25+、B220+細胞亞群變化情況。結果:EAE組小鼠中樞神經系統有CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD4+CD25+、B220+淋巴細胞的浸潤,CFA陰性對照組中樞神經系統未檢測到淋巴細胞浸潤。EAE組小鼠外周脾細胞中CD3+CD4+、CD3+CD8+細胞較CFA陰性對照組減少（P＜0.05）,B220+細胞較CFA陰性對照組明顯升高（P＜0.01）,CD4+CD25+細胞較CFA陰性對照組升高但無統計學差異。結論:小鼠在EAE發病高峰期,外周脾細胞中CD3+CD4+、CD3+CD8+陽性細胞明顯減少,B220+明顯升高,CD4+CD25+也開始有升高趨勢,表明EAE發病高峰期細胞免疫及體液免疫共同調控了EAE的病理過程,T淋巴細胞與B淋巴細胞都起了很重要的主導作用。

實驗性自身免疫性腦脊髓炎;淋巴細胞亞群;多發性硬化;T淋巴細胞;B淋巴細胞

多發性硬化（Multipule sclerosis,MS）是一種以中樞神經系統（Centralnervous system,CNS）白質炎性脫髓鞘為主要病理特點的自身免疫性疾病,其確切病因及發病機制尚未闡明。目前認為MS是由CD4+T細胞介導的自身免疫性疾病,激活的T細胞通過血腦屏障（Blood brain barrier,BBB）與中樞的抗原遞呈細胞（Antigen presenting cell,APC）,即小膠質細胞與星形膠質細胞呈遞的靶抗原結合,繼而產生炎癥細胞因子的分泌,進一步促使巨噬細胞、B細胞的活化,導致神經組織的炎癥脫髓鞘反應及神經軸索的損害。隨著對MS研究的不斷深入,B細胞在MS發病中的作用越來越受到人們重視。腦脊液中持續的鞘內免疫球蛋白（IgG）的合成和寡克隆區帶的產生已成為一項診斷MS的重要免疫學指標。然而在MS中體液免疫及細胞免疫病理機制仍未完全闡明。

成熟T細胞可分為CD4+、CD8+T淋巴細胞,CD4+T細胞主要參與輔助作用（TH）及遲發超敏反應（TDTH）,CD8+T細胞主要參與細胞毒作用（TC）及免疫抑制（TS）作用。CD4+與CD8+細胞的數量及比值的變化將影響到機體的免疫平衡。而CD4+CD25+細胞,即調節性T淋巴細胞可以抑制CD4+與CD8+細胞的增殖,在機體免疫平衡中也發揮著重要作用。

由于MS患者標本只能檢測到患者外周血及腦脊液中淋巴細胞變化,限制了對MS中樞細胞病理機制的深入研究。目前MOG35-55誘導的實驗性自身免疫性腦脊髓炎（Experimentalautoimmune encephalom yelitis,EAE）可模擬MS神經功能及病理學上的改變,是一種公認的MS動物模型[1]。我實驗室已用MOG35-55成功誘導出穩定的小鼠EAE模型[2]。本實驗通過對EAE組小鼠大腦、脊髓及外周脾細胞中淋巴細胞的分離及檢測,試圖分析在EAE發病過程中外周及中樞部分T、B淋巴細胞亞群的變化。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑及儀器 SPF級野生型C57BL/6小鼠（由美國波士頓大學醫學中心提供）,雌性,6～8周齡,體重18～20克,12只。MOG35-55,純度＞95%（MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK）,購于西安聯美生物科技有限公司;人結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis,H37RA）購于美國Difco公司;不完全弗氏佐劑（Freund′s ad juvant incomplete,IFA）、百日咳毒素（Pertussis toxin,PT）、淋巴細胞分離液（Percoll液）購于Sigma公司;淋巴細胞表面標記抗體CD3（APCHamsteranti-mouse）、CD4（FITCanti-mouse）、CD8（PE anti-mouse）、CD25（APC anti-mouse）、CD25 對照（APC Rat IgG1 Isotype Control）、B220（PE-Cy5.5 anti-mouse/humanCD45R）購于美國eBioscience公司;流式細胞儀（FACSCalibur）為BD公司產品;水平離心機為Beckman公司產品。

1.2 EAE模型制作 小鼠分組:野生型EAE組6只;野生型CFA陰性對照組6只。

抗原配制及EAE模型制作:①抗原配制:將MOG35-55用 0.01 mol/L的 PBS稀釋成 1 mg/0.45ml的溶液;將8 mg的H 37RA用1ml的IFA稀釋成8 mg/m l的CFA溶液;將MOG稀釋溶液與CFA溶液等體積接三通管冰浴快速混勻10分鐘,至油包水狀態,即為抗原乳劑。②EAE模型制作:EAE組,小鼠背部分4點皮下注射抗原乳劑0.2m l/只;CFA陰性對照組,用0.01mol/L的PBS代替MOG35-55稀釋溶液與CFA溶液等體積混合制備抗原乳劑,過程同EAE組抗原乳劑制備。免疫后0、48小時給予腹腔注射500 ng/0.95m l PBS的PT溶液0.2m l。自免疫當日起每天早晚稱量小鼠體重,觀察小鼠行為及神經功能表現,發病開始記錄神經功能評分以便了解病情進展。

1.3 神經功能評分及標準 使用較為敏感的Weaver 15分法[3]累計積分,其標準為:尾巴:無異常0分、尾半癱 1分、尾全癱 2分;四肢:無異常 0分、步態改變1分、輕癱2分、全癱3分（四個肢體分別評分后累加）;死亡15分。

1.4 組織病理學評分 小鼠發病高峰期麻醉后心臟灌注處死,取腰髓做石蠟包埋,每隔25μm間斷連續切片,片厚5μm,然后進行蘇木精-伊紅染色,光鏡下觀察病理變化,評分標準[4]（Okuda 1998）如下:400倍鏡下計數:沒有炎癥變化為0;炎癥細胞浸潤僅限于血管周圍為1;脊髓內輕微的炎癥細胞浸潤為2（1～10/視野）;脊髓內中度的炎癥細胞浸潤為 3（11～100/視野）;脊髓內重度炎癥細胞浸潤為4（＞100/視野）。

1.5 外周及中樞淋巴細胞分離及檢測 小鼠發病高峰期麻醉后心臟灌注處死,無菌條件下取一半大腦、腦干、頸胸髓、脾臟置于裝有預冷PBS的培養皿中,傳至超凈臺處理。

將頸胸髓及大腦、腦干的脊膜、腦膜去除干凈,組織分離成小塊,小心研磨使腦組織中的淋巴細胞充分游離,用200目尼龍網過濾,離心后用 40%的Percoll液重懸,小心將混合液移至70%Percoll液液面上方,注意保持分界面不被破壞,然后使用水平離心機JS 5.3、600 r/m in、25℃、20分鐘分離淋巴細胞。離心后MOG組標本出現一白色霧狀層,即為淋巴細胞所在層面,將其吸出用含2%BSA的0.01 mol/L的DPBS液清洗。細胞計數后取104細胞加淋巴細胞表面標記抗體CD3、CD4、CD8、CD25、B220及陰性對照,暗室孵育30分鐘,1ml PBS充分清洗細胞,用1%pH7.2的多聚甲醛液150μl將細胞固定待檢。

將脾臟周圍脂肪及纖維組織去除干凈,用針刺法制備脾細胞懸液,收集細胞后用紅細胞裂解液充分去除紅細胞,PBS清洗、細胞計數后將106脾細胞加淋巴細胞表面標記抗體 CD3、CD4、CD8、CD25、B220及陰性對照,之后操作同中樞標本制備。

細胞標本用FACS-Calibur流式細胞儀對淋巴細胞表面標記抗體進行分選檢測,數據采用CellQuest 3.2軟件分析。

1.6 統計學方法 使用SPSS16.0統計軟件進行統計分析,臨床癥狀評分、潛伏期、達峰時間、病理評分、淋巴細胞所占百分數用±s表示,兩樣本比較用獨立樣本t檢驗。

2 結果

2.1 EAE發病情況 EAE組小鼠臨床癥狀最早出現于免疫后第12天,最遲在免疫后16天,潛伏期為（12.83±1.83）天,癥狀在3～6天達高峰,達峰時間為（18.17±1.94）天。EAE組6只小鼠全部發病,最大癥狀評分為（8.83±3.26）分。發病期小鼠多數以尾部遠端張力下降、行走時尾尖部拖地為首發癥狀,少數以行走時步態搖晃為首發,繼而出現全尾癱瘓、后肢無力、后肢癱瘓、前肢無力等癥狀。另外還表現為活動減少、食欲降低、毛色暗淡、體重減輕（見圖1、2）等。

圖1 免疫后CFA組及EAE組小鼠平均體重變化Fig.1 Weight change in CFA and EAE group after immunization

圖2 免疫后CFA組及EAE組小鼠日均評分Fig.2 Mean daily clinical scores in CFA and EAE group after immunization

2.2 病理學改變 蘇木精-伊紅染色（見圖3、4）,EAE小鼠發病高峰期都可觀察到腰髓有大量的炎性細胞浸潤,以淋巴細胞為主,多分布于灰質與白質交界處,發病較嚴重的可見脊膜不完整,并有大量淋巴細胞浸潤。部分小血管周圍被炎癥細胞浸潤,形成典型的“血管袖套樣”（Cuffing）改變,并且病理評分與神經功能評分基本符合。

2.3 淋巴細胞變化 EAE組高峰期小鼠外周脾細胞中CD3+CD4+、CD3+CD8+細胞較CFA陰性對照組減少（P＜0.05）,B220+細胞較CFA陰性對照組明顯升高（P＜0.01）,CD4+/CD8+、CD4+CD25+細胞較CFA陰性對照組升高但無統計學差異。EAE組高峰期小鼠中樞神經組織（大腦、腦干、頸胸髓）CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD4+CD25+、B220+淋巴細胞浸潤明顯,而CFA陰性對照組小鼠中樞未檢測到淋巴細胞浸潤（見表1、圖5～8）。

圖3 CFA陰性對照組小鼠腰髓（蘇木精-伊紅染色,×400）Fig.3 Lumbar cord of CFA controlgroup（stained by HE,×400）

圖4 EAE組小鼠腰髓可見灰質明顯炎癥細胞浸潤（蘇木精-伊紅染色,×400）Fig.4 Thereare obvious in flammatory cells infiltrating in grey matter in lumbar cord of EAE group（stained by HE,×400）

表1 EAE組與CFA組不同淋巴細胞亞群所占比例比較Tab.1 Comparisons of percentages of lymphocyte subsets between EAE and CFA groups

圖5 流式細胞儀分析CFA陰性對照組外周脾臟淋巴細胞（CFA）中 CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD4+CD25+、B220+所占百分數Fig.5 The percents of CD3+CD4+,CD3+CD8+,CD4+CD25+,B220+in the periphery lymphocytes of CFA control group（CFA）,analyzed by flow cy tometry

圖6 流式細胞儀分析EAE組高峰期外周脾臟淋巴細胞（S）中 CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD4+CD25+、B220+細胞所占百分數Fig.6 The percents of CD3+CD4+,CD3+CD8+,CD4+CD25+,B220+cell in the periphery lymphocytes of EAE crest-time group（S）,analyzed by flow cytometry

圖7 流式細胞儀分析EAE組高峰期中樞神經組織淋巴細胞（B）中 CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD4+CD25+、B220+所占百分數Fig.7 The percents of CD3+CD4+,CD3+CD8+,CD4+CD25+,B220+in the center nervous system lymphocytes of EAE crest-time group（B）,ana lyzed by flow cy tometry

圖8 高峰期EAE組與CFA組不同淋巴細胞亞群所占比例比較Fig.8 Comparisons of percentages of lymphocyte subsets between EAE crest-time group and CFA group

3 討論

MOG35-55誘導C57BL/6小鼠的EAE是MS的一種經典模型,本實驗中EAE組小鼠行為學表現為發病期體重下降、尾巴癱瘓、步態異常及不同程度的肢體癱瘓等,其病程在第一個發病高峰期以內呈現慢性遷延性,病理見腰髓白質為主的炎性細胞浸潤和血管“袖套”樣改變等,與文獻[1,2]報道相符合,提示本次實驗誘導的EAE模型是成功的,神經功能損傷表現及病理學表現都比較典型。

Mix等[5,6]發現MS患者外周血中CD4+、CD8+細胞數量下降,CD4+/CD8+上升,在腦脊液中CD4+細胞數量及CD4+/CD8+上升,而CD8+細胞數量下降。在本次實驗中,EAE組外周及中樞淋巴細胞分離采用流式細胞儀檢測結果符合文獻報道MS患者外周血及腦脊液淋巴細胞改變,提示在EAE高峰期外周淋巴細胞通過血腦屏障向中樞浸潤,而且CD4+輔助性T細胞增多占優勢。

CD4+CD25+調節性T細胞是一類具有免疫調節功能的T細胞亞群,可以抑制CD4+、CD8+T細胞。多數研究發現,在MS患者外周血中 CD4+CD25+調節性T細胞免疫抑制作用減弱,而其數量無明顯變化[7,8]。而在多數 EAE研究中也發現CD4+CD25+調節性T細胞免疫抑制功能缺失時病情明顯加重,轉輸功能正常的異體小鼠Treg對發病有抑制作用,明顯減輕病理損傷[9,10]。Feger等[11-13]研究發現復發-緩解型MS（Relapse-remitting MS,RRMS）患者Treg數量略有增多,其中記憶性Treg比例增多,而 CD4+CD25+Foxp3+顯著減少,抑制 T細胞活化功能減弱。本實驗中 EAE組外周、中樞CD4+CD25+T淋巴細胞數稍有增多,但未進行進一步分型及功能檢測,提示此次檢測到的CD4+CD25+T淋巴細胞多數屬于記憶性Treg細胞。

目前多數學者對B細胞在MS等自身免疫性疾病中的作用及MS的免疫啟動機制提出質疑[14]。Mathey等[15]在繼發-進展型MS患者的血清中發現高濃度的針對神經束蛋白的抗體,而注射抗神經束蛋白抗體至EAE模型鼠可導致疾病的惡化。然而,Bourdette等[16]利用利妥昔單抗治療復發緩解型MS（RRMS）的Ⅱ期臨床試驗結果顯示了該藥對B細胞消減治療的卓越療效。Matsushita等[17]研究發現誘導EAE之前7天使小鼠B細胞缺失結果加重小鼠發病,而誘導EAE 14天后使小鼠B細胞缺失可減輕小鼠發病。實驗推測B細胞不同亞型在EAE不同時相發揮不同的作用。本實驗發現EAE組高峰期小鼠外周B細胞較CFA陰性對照組明顯升高,而且EAE組高峰期小鼠中樞B細胞較外周又有升高,提示B細胞參與了EAE發病過程。

以往認為,Th2細胞通過分泌IL-4刺激B細胞增殖和Ig類別轉換,上調B細胞CD40和MHCⅡ類分子的表達,是輔助B細胞主要的T細胞亞群。而最近發現濾泡輔助性T細胞（T follicularhelper cells,Tfh）是主要負責輔助B細胞的T細胞亞群[18]。本次試驗結果提示B細胞的異常同T細胞一起調控了EAE高峰期的病理變化過程,即在EAE發病過程中細胞免疫及體液免疫共同發揮了重要作用,在炎癥高峰期,隨著康復期的即將來臨,B細胞的增殖與功能已開始發揮主導作用。EAE疾病進展中很可能是通過B細胞與T細胞之間的相互作用及其不同細胞亞型的變化來進一步調節中樞的細胞與體液免疫反應,相關的分子免疫病理有待深入研究。

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[收稿2009-10-20 修回2009-12-14]

（編輯 張曉舟）

The change of periphery and central lymphocyte subsets at the crest-time of experimental autoimmune encephalomyelitism ice

XINa-Na,ZHENGRong-Yuan,SHANGXiao-Feng,WANGTan,LüJin,XUDe,WUZheng-Gang,CHENGuo-Qian.DepartmentofNeurology,theFirstAffiliatedHospitalofWenzhouMedicalCollege,Wenzhou325000,China

Objective:Toobserve the change of periphery and centra lymphocyte subsets at the crest-time of MOG35-55induced EAE disease inmice,and to exp lore the alteration of cellular immunity and humoral immunity in the invasion process in EAE.Methods:MOG35-55was used to establish EAEmodel in femina C57BL/6 mice.The behavioral changes and the histological scoreswere recorded after them ice were immuned.The changes of CD3+CD4+,CD3+CD8+,CD4+CD25+and B220+on periphery and centra lymphocytes in spleen,brain and spinal cord were analyzed by flow cytometry.Results:The CD3+CD4+,CD3+CD8+,CD4+CD25+and B220+lymphocyteswere detected in thebrain and spinal cord of EAE groupmice,but theywere notdetected in CFA controlgroup.The CD3+CD4+and CD3+CD8+lymphocytes in the spleen of EAE crest-time group were lower than those in CFA control group（P＜0.05）.The B220+lymphocyteswereobviously higher than in the CFA controlgroup（P＜0.01）.And CD4+CD25+lymphocyteswere slighthigher than the CFA controlgroup.Conclusion:At the crest-time during EAE,the CD3+CD4+,CD3+CD8+lymphocytes of spleen reduced obviously,B220+lymphocytesincreasedmarkedly,and the CD4+CD25+lymphocytes justhave the increasing trend.It indicates that cellular immunity and humoral immunity coregulated the patho-p rocess at the crest-time of EAE,T lymphocytes and B lymphocytes all played important roles in the pathogenesy of EAE.

Experimental autoimmune encephalomyelitis;Lymphocyte subset;Multiple sclerosis;T lymphocyte;B lymphocyte

R744.5

A

1000-484X（2010）03-0236-05

①本文為省部共建基金（wkj:2005-2-041）

席娜娜（1982年-）,女,在讀碩士,主要從事脫髓鞘疾病及神經免疫學的研究,E-mail:xinana0844@163.com;

及指導教師:鄭榮遠（1949年-）,男,教授,博士生導師,主要從事脫髓鞘疾病及神經免疫學、神經藥理學的研究,E-mail:zhengry@yahoo.com.cn。