Ghrelin活化人T細(xì)胞翻譯起始分子通過m TOR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路①

崔天盆 胡必成 （武漢市第一醫(yī)院臨床免疫學(xué)實驗室,武漢 430022）

Ghrelin活化人T細(xì)胞翻譯起始分子通過m TOR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路①

崔天盆 胡必成 （武漢市第一醫(yī)院臨床免疫學(xué)實驗室,武漢 430022）

目的:探討Ghrelin活化人T細(xì)胞翻譯起始分子的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機理。方法:采用微柱法分離人外周血T細(xì)胞,采用Western blot方法檢測mTOR信號通路分子和蛋白質(zhì)翻譯調(diào)控分子的磷酸化狀態(tài)和含量。采用mTOR抑制劑:雷帕霉素,PI3KⅠ抑制劑:LY294002,PI3KⅢ抑制劑:3-甲基腺嘌呤,Ghrelin拮抗劑:Des-Lys-3-GHRP6和AKT抑制劑:A443654和Ghrelin研究相應(yīng)信號通路。結(jié)果:①人T細(xì)胞表面有Ghrelin受體（GHSR1a）表達(dá)。②Ghrelin與GHSR1a結(jié)合后可活化mTOR。③Ghrelin磷酸化兩個mTOR下游靶分子4E-BP-1和P70S6K,P70S6K進(jìn)一步磷酸化核糖體S6蛋白。④Ghrelin磷酸化蛋白質(zhì)翻譯起始帽子結(jié)構(gòu)的兩個重要分子eIF4E和eIF4G。結(jié)論:Ghrelin促進(jìn)人T細(xì)胞mRNA翻譯起始的機理是活化mTOR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。

Ghrelin;哺乳類雷帕霉素靶蛋白;T細(xì)胞;蛋白質(zhì)翻譯

Ghrelin是由胃X/A樣內(nèi)分泌細(xì)胞分泌的胃腸肽激素,饑餓時血中濃度最高,進(jìn)食1小時后最低。GHRP-6是最早發(fā)現(xiàn)的不與生長激素釋放激素受體結(jié)合的促進(jìn)生長激素分泌的多肽,隨后發(fā)現(xiàn)一系列肽類和非肽類促生長激素分泌的化合物,稱之為生長激素促分泌素（growth hormone secretagogues,GHSs）,1995年Howard[1]從垂體和下丘腦克隆到可與GHS結(jié)合的孤兒受體——生長激素促分泌素受體1a（GH secretagogue receptor 1a,GHSR1a）。然而直到1999年Kojima[2]才從胃中克隆純化GHSR1a內(nèi)源性配體——Ghrelin。Ghrelin是含 28個氨基酸的多肽,Ghrelin氨基端第三位絲氨酸被辛烷化,且目前認(rèn)為辛烷化Ghrelin可與GHSR結(jié)合,是Ghrelin的活化形式。Ghrelin能促進(jìn)進(jìn)食和體重的增加,其促進(jìn)進(jìn)食的效應(yīng)強于目前已知的神經(jīng)肽Y（neuropeptide Y,NPY）,而且長期應(yīng)用Ghrelin能增加體重。此外Ghrelin/GHSR1a還有其他中樞和外周功能,如激素分泌、血糖穩(wěn)定、胰腺功能、生殖、胃腸蠕動、心血管功能、細(xì)胞分化和生存、免疫和炎癥、骨代謝、記憶和睡眠等。Ghrelin的系列功能是通過Ghrelin與GHSR1a結(jié)合從而啟動胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)來實現(xiàn)的。

不同作者對Ghrelin與GHSR1a結(jié)合后啟動的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機理進(jìn)行研究[3,4]。發(fā)現(xiàn)一些信號分子參與Ghrelin的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。使用HEK293和CHO細(xì)胞表達(dá)GHSR1a,通過同位素結(jié)合分析、激光共聚焦顯微鏡分析,受體活化后胞內(nèi)Ca2+濃度升高。Ghrelin作用于豬生長激素細(xì)胞通過AC/PKA、PLC/PKC和胞內(nèi)鈣通路轉(zhuǎn)導(dǎo)信號。除了Ghrelin介導(dǎo)的離子電流效應(yīng),Ghrelin通過MAPK介導(dǎo)細(xì)胞分化功能,采用CHO細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)GHSR1a模型,研究發(fā)現(xiàn)Ghrelin通過PLC、PKCε活化 ERK1/2通路。然而在3T3-L1前脂肪細(xì)胞,Ghrelin通過PI-3K/AKT和百日咳毒素敏感G蛋白（Gi/o）活化MAPK。在胰腺癌細(xì)胞也發(fā)現(xiàn)通過PI3-K/AKT通路。在人和大鼠腎上腺小球細(xì)胞（adrenal zona glomerulosa cells）,Ghrelin促進(jìn)細(xì)胞分化通過ERK1/2,而不依賴PKA和PKC。在肝細(xì)胞,Ghrelin磷酸化IRS-1和結(jié)頭蛋白-生長因子受體結(jié)合蛋白2及MAPK,因此在這種細(xì)胞GHSR的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與胰島素的信號分子交叉,Ghrelin和胰島素聯(lián)合應(yīng)用可增加IRS-1的磷酸化。

人T細(xì)胞和單核細(xì)胞表達(dá)Ghrelin和Ghrelin受體,Ghrelin通過Ghrelin受體特異性抑制前炎性細(xì)胞因子如IL-1β、IL-6和TNF-α的表達(dá)。Ghrelin以劑量依賴方式抑制瘦素誘導(dǎo)的前炎性細(xì)胞因子表達(dá)。用Ghrelin治療LPS誘導(dǎo)鼠內(nèi)毒素模型,發(fā)現(xiàn)Ghrelin有抗炎效應(yīng)。應(yīng)用Ghrelin或GHSR激活有助于改善疾病相關(guān)的惡液質(zhì)。

隨著年齡增長,胸腺表達(dá)Ghrelin和Ghrelin受體減低,用Ghrelin治療14月齡小鼠可顯著改善胸腺結(jié)構(gòu)和增加胸腺細(xì)胞數(shù)量,增加胸腺流出和改善外周T細(xì)胞TCR多樣性[5,6]。

本文旨在研究Ghrelin作用T細(xì)胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機理,由于Ghrelin的基本功能是調(diào)節(jié)機體進(jìn)食、代謝和能量平衡,因此我們選擇哺乳類雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin,mTOR）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路作為研究對象。

1 材料與方法

1.1 研究對象 健康獻(xiàn)血者,年齡35～55歲,不吸煙,無過敏史。采集外周血200m l。

1.2 試劑 高純度人Ghrelin（純度=98.7%）購自EZbiolab公司（EZbiolab Inc.Westfield,IN 46074,USA）;（D-Lys3）-GHRP-6（純度＞95%,Phoenix Pharmaceuticals Inc.Burlingame,CA 94010,USA）。PI3K 抑制劑—LY294002（Calbiochem,La Jolla,CA）,雷帕霉素（rapamycin,Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA）。3-甲基腺嘌呤（Sigma:M 9281）;Akt inhibitor（2S）-1-（1HIndol-3-yl）-3-[5-（3-methyl-2H-indazol-5-yl）pyridin-3-yl]oxypropan2-amine（A443654,Invitrogen）,RIPA緩沖液（Sigma R0278,Saint Louis,M issouri 63103）,蛋白酶抑制劑（Protease inhibitor cocktail,Sigama P8340）,磷酸酶抑制劑（Phosphatase inhibitor cocktail1,Sigma P8340和Phosphatase inhibitor cocktail2,Sigma P5726）。

1.2 研究方法

1.2.1 人T細(xì)胞分離 首先用Ficoll分離液分離人外周血單個核細(xì)胞（包括淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞）,用R&D公司（R&D Systems,Minneapolis,Minnesota,USA）的T細(xì)胞富集柱（Cat#:HTCC-25）用高親和陰性選擇法分離T細(xì)胞,具體參照R&D公司的使用說明書,T細(xì)胞純度為95%。簡言之,外周血單個核細(xì)胞通過抗免疫球蛋白包被的T細(xì)胞富集柱,B細(xì)胞通過BCR與抗體結(jié)合,而單核細(xì)胞通過Fc受體結(jié)合后留在富集柱上,用相應(yīng)緩沖液洗滌三次,得到純度大于95%的T細(xì)胞。

1.2.2 免疫印跡（Western blot） 人外周血T細(xì)胞加入含青霉素、鏈霉素的RPMI,37℃5%CO2培養(yǎng)箱中,血清饑餓過夜。使用Ghrelin或適當(dāng)抑制劑,每10×106人外周血T細(xì)胞加入0.1 ml含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA緩沖液,T細(xì)胞RIPA裂解液置冰上15分鐘,4℃14 000 r/min離心15分鐘,上清轉(zhuǎn)入另一近潔凈EP管,采用BCATM（PIERCE,23227,Rockford,IL,USA）蛋白定量分析檢測蛋白含量。2～20μg蛋白采用Invitrogen公司的4%～12%梯度Bis-Tris聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白,電轉(zhuǎn)移到0.22μm PVDF膜。已轉(zhuǎn)印的PVDF膜置5%脫脂奶粉-TBST室溫中振蕩封閉 1小時。已轉(zhuǎn)印的PVDF膜置于適當(dāng)稀釋的第一抗體中4℃旋轉(zhuǎn)過夜;然后在室溫下用1×TBST洗膜三次,每次10分鐘;將膜置于適當(dāng)稀釋的含辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（horseradish peroxidase-labeled Goat anti-Rabbit IgG（H+L）,Southern Biotech.Birmingham,Alabama 35209;或donkey anti-mouse IgG-HRP,Santa Cruz Biotech,sc-2096）的1×TBST中,室溫振蕩 1小時;室溫條件下用1×TBST洗膜三次,每次10分鐘。最后采用ECLplus化學(xué)發(fā)光底物（ECLplus,Amersham Place,Little Chalfont,Buckinghamshire,UK）,具體根據(jù)使用說明書操作。用PIERCE公司X線膠片曝光記錄結(jié)果,使用Alpha Innotech Imaging system公司掃描。所用抗體如下:GHS-R1 antibody（D-16）（Santa Cruz Biotechnology Inc.sc-10362,Santa Cruz,CA95060）.PhosphomTOR（Ser2448）antibody（Cell Signaling,#2971,Danvers,MA01923）,mTOR antibody（Cell Signaling,#2972）;Phospho-p70 S6 kinase（Thr389）rabbitmonoclonal antibody（Cell Signaling#9234）,Anti-p70 S6 kinase antibody（Upstate,#06-926）;Anti-phospho-ribosomal protein S6（Ser235）antibody（Upstate,#05-795）,S6 ribosomal protein（54D2）mousemAB（Cell signaling,#2317）,Phospho-4E-BP1（Ser65）antibody（Cell Signaling,#9451）,4E-BP1 antibody（Cell Signaling,#9452）;Phospho-eIF4E（Ser209）antibody（Cell Signaling,#9741）,eIF4E antibody（Santa Cruz,sc-9976）;）;Phospho-eIF4G（Ser1108）antibody（Cell Signaling,#2441）,eIF4G antibody（SantaCruz,sc-11373）。

2 結(jié)果

2.1 人T細(xì)胞表達(dá)GHSR1a T細(xì)胞富集柱分離的T細(xì)胞,采用免疫印跡法檢測,人T細(xì)胞表達(dá)GHSR1a。具體見圖1。

2.2 Ghrelin與GHSR1a結(jié)合誘導(dǎo)mTOR磷酸化 哺乳類雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin,mTOR）是保守的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶,在細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中有重要作用,mTOR可調(diào)控正常細(xì)胞或癌細(xì)胞蛋白質(zhì)合成、細(xì)胞分化和細(xì)胞體積增大。

100 ng/mlGhrelin誘導(dǎo)mTOR 2448位絲氨酸磷酸化和活化,10分鐘開始活化,30分鐘達(dá)高峰,進(jìn)一步活化下游P70 S6激酶389位蘇氨酸磷酸化和活化;活化的P70 S6激酶進(jìn)一步活化更下游的核糖體S6蛋白的235位絲氨酸的磷酸化和活化,見圖2。雷帕霉素則抑制Ghrelin誘導(dǎo)的磷酸化和活化,見圖3,表明Ghrelin誘導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)依賴mTOR的活化。

2.3 Ghrelin誘導(dǎo)mTOR磷酸化通過GHSR1a、PI3K和AKT 人 T細(xì)胞與 1μmol/L Des-Lys-3-GHRP6（ghrelin拮抗劑）,50μmol/L LY294002（PI3KⅠ抑制劑）,4 mmol/L 3-甲基腺嘌呤（3-Methyladenine,PI3KⅢ抑制劑）,1μmol/LA443654（AKT抑制劑）,20 ng/m l雷帕霉素（mTOR抑制劑）37℃孵育1小時;采用Ghrelin分別治療未處理和抑制劑處理人T細(xì)胞,37℃15分鐘。采用免疫印跡檢測mTOR 2448位絲氨酸磷酸化強度,見圖3。Ghrelin誘導(dǎo)mTOR 2448位絲氨酸磷酸化和P70S6激酶389位蘇氨酸磷酸化可被Des-Lys-3-GHRP6、LY294002、3-甲基腺嘌呤和雷帕霉素所抑制。

2.4 Ghrelin誘導(dǎo)mRNA翻譯起始調(diào)控分子4E-BP-1、eIF4E和eIF4G磷酸化 Ghrelin誘導(dǎo)mTOR 2448位絲氨酸磷酸化和活化,進(jìn)一步磷酸化下游mRNA翻譯抑制因子—真核翻譯起始因子4結(jié)合蛋白-1（4E-BP-1）,15分鐘開始活化,30分鐘達(dá)高峰,4E-BP-1的65位絲氨酸磷酸化后,4E-BP-1與eIF4E的結(jié)合解除,4E-BP-1對eIF4E的抑制也解除,eIF4E與eIF4G和eIF4A組成復(fù)合物稱之為eIF4F,eIF4F與mRNA帽子結(jié)構(gòu)結(jié)合啟動翻譯。

圖1 人T細(xì)胞表達(dá)Ghrelin受體Fig.1 Human T cells express GHSR1a

Ghrelin快速誘導(dǎo)eIF4E 209位絲氨酸磷酸化,5分鐘即達(dá)高峰,而eIF4G 1108位絲氨酸磷酸化15分鐘則達(dá)到高峰。eIF4E 209位絲氨酸磷酸化和eIF4G 1108位絲氨酸磷酸化也有助于蛋白質(zhì)翻譯起始,見圖4。

圖2 Ghrelin誘導(dǎo)人T細(xì)胞m TOR、p70 S6K和核糖體S6蛋白的磷酸化Fig.2 Ghrelin induces phosphorylation of m TOR,p70 S6K and S6 ribosomal p rotein in human p rimary T cells

圖3 Ghrelin誘導(dǎo)人T細(xì)胞m TOR,P70 S6K和核糖體S6蛋白的磷酸化依賴GHSR1a,PI3K,AKTFig.3 Ghrelin-mediatedm TOR P70S6 phosphorylation isGHSR1a,PI3K,AKT dependent

圖4 Ghrelin誘導(dǎo)人 T細(xì)胞4E-BP-1、eIF4E和 eIF4G的磷酸化Fig.4 Ghrelin induces phosphorylation of 4E-BP1,eIF4E and eIF4G

3 討論

Ghrelin是28個氨基酸組成的多肽,其第3位絲氨酸在Ghrelin酰化酶（GOAT）作用下辛烷化,且3位絲氨酸的辛烷化對其發(fā)揮生物活性來說是必需的[7]。到目前為止,Ghrelin被中鏈脂肪酸修飾在激素中是唯一的。血清中也存在去酰化Ghrelin（Desacyl-Ghrelin）,其含量遠(yuǎn)高于Ghrelin。正常人血清Ghrelin濃度是10～20 pmol/L,而總Ghrelin（包括Ghrelin和去酰化Ghrelin）的濃度是100～150 pmol/L,短期饑餓情況下血漿Ghrelin濃度升高,進(jìn)食后血漿Ghrelin濃度降低。McCowen和Shiiya等研究表明口服或靜脈注射葡萄糖可降低血漿Ghrelin濃度;喝水則不改變血漿Ghrelin濃度。肥胖者Ghrelin濃度低而消瘦者高。腫瘤、心衰或慢性消耗性疾病所致惡病質(zhì)Ghrelin濃度升高。

免疫和神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)具有雙向調(diào)節(jié)作用,生長激素和饑餓激素Ghrelin表達(dá)于不同的免疫細(xì)胞,如T細(xì)胞、B細(xì)胞、單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞;免疫細(xì)胞也有生長激素受體和Ghrelin受體[8,9]。像Ghrelin作用于垂體細(xì)胞一樣,Ghrelin作用于免疫細(xì)胞表達(dá)生長激素。然而調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞表達(dá)生長激素分泌與其他作用于垂體不同,細(xì)胞因子和絲裂原促進(jìn)免疫細(xì)胞分泌生長激素,Ghrelin的生物活性包括減輕內(nèi)毒素休克和抗炎作用,調(diào)節(jié)吞噬和增加胸腺生成。

mTOR是保守的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶,在細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中有重要作用,mTOR可調(diào)控細(xì)胞蛋白質(zhì)合成、細(xì)胞分化和細(xì)胞體積的增大[10]。mTOR對T細(xì)胞蛋白質(zhì)合成也有重要作用[11]。

本文研究發(fā)現(xiàn)人T細(xì)胞表達(dá)Ghrelin受體,Ghrelin通過GHSR1a活化T細(xì)胞mTOR通路。Ghrelin誘導(dǎo)mTOR和P70 S6磷酸化可被Des-Lys-3-GHRP6、雷帕霉素、LY294002、3-甲基腺嘌呤和A443654所抑制,表明Ghrelin活化T細(xì)胞mTOR通路是通過GHSR1a、mTOR、PI3K I和 Ⅲ以及AKT。

Ghrelin誘導(dǎo)mTOR 2448位絲氨酸磷酸化和活化,進(jìn)一步磷酸化下游mRNA翻譯抑制因子—真核翻譯起始因子4結(jié)合蛋白-1的65位絲氨酸磷酸化后,4E-BP-1與eIF4E的結(jié)合解除,4E-BP-1對eIF4E的抑制也解除,eIF4E與eIF4G和eIF4A組成復(fù)合物稱之為eIF4F,eIF4F與mRNA帽子結(jié)構(gòu)結(jié)合啟動翻譯。eIF4E 209位絲氨酸磷酸化和eIF4G 1108位絲氨酸磷酸化也有助于翻譯起始。因此Ghrelin活化T細(xì)胞mTOR通路有助于蛋白質(zhì)翻譯起始。

總之,Ghrelin促進(jìn)人T細(xì)胞mRNA翻譯起始的機理是活化mTOR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,這也是第一個報道Ghrelin可在細(xì)胞水平活化mTOR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,將細(xì)胞代謝與免疫聯(lián)系起來。

1 Howard A D,Feighner SD,Cully D Fetal.A receptor in pituitary and hypothalamus that functions in growth hormone release[J].Science,1996;273（5277）:974-977.

2 KojimaM,Hosoda H,Nakazato Metal.Ghrelin is a growth-hormone-releasing acylated peptide from stomach[J].Nature,1999;402（6762）:656-660.

3 Mousseaux D,LeGallic L,Ryan Jetal.RegulationofERK1/2 activity by ghrelin-activated growth hormone secretagogue receptor 1A involves a PLC/PKCepsilon pathway[J].Br JPharmacol,2006;148（3）:350-365.

4 Camina JP,LodeiroM,Ischenko Oetal.Stimulation by ghrelin of p42/p44mitogen-activated protein kinase through the GHS-R1a receptor:role ofG-proteins and beta-arrestins[J].JCell Physiol,2007;213（1）:187-200.

5 Dixit V D,Schaffer EM,Pyle RSetal.Ghrelin inhibits leptin-and activation-induced proinflammatory cytokine expression by human monocytes and T cells[J].JClin Invest,2004;114:57-66.

6 DixitV D,YangH,Sun Yetal.Ghrelin promotes thymopoiesis duringaging[J].JClin Invest,2007;117（10）:2778-2790.

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11 Beretta L.Translational control in T lymphocytes[J].Int Rev Immunol,2004;23（3-4）:347-363.

[收稿2009-09-03 修回2009-11-29]

（編輯 許四平）

Ghrelin activates translation initiate factor in human T cells through m TOR pathway

CUITian-Pen,HUBi-Cheng.LaboratoryofClinicalImmunology,WuhanNo.1Hospital,Wuhan430022,China

Objective:Ghrelin is a brain-gut peptide with GH-releasing,apetide-inducing and anti-inflammation activities and with widespread tissue distribution.Ghrelin is the endogenous ligand of GH secretagogue receptor（GHSR）,and both ghrelin and theGHSR are expressed in T cells.We therefore examined the effectofGhrelin on human T celland its signal transduction.Methods:Ghrelin-activatingmTOR pathway in human primary T cellwas studied using immunoblotting and inhibitors of the PI3K（LY294002,3-Methyladenine）ormTOR（rapamycin）and antagonistof GHSR1a（Des-Lys-3-GHRP6）.Results:The results showed thatGHSR1a was expressed on T cells.Ghrelin caused a significant increase in the phosphorylatedmTOR,P70S6K,S6K,4E-BP-1,eIF4G,eIF4Eby immunoblotting.While the phosphorylatedmTOR,P70S6K were abolished by themTOR inhibitor rapamycin and PI3K inhibitor LY294002,3-methyladenine and alsoantagonistof GHSR1a,Des-Lys-3-GHRP6.Conclusion:The data document thatGhrelin activates translation of T cells throughmTOR pathway.

Ghrelin;mTOR;T cell;Translation

R392

A

1000-484X（2010）03-0205-05

①本課題為武漢市人事局留學(xué)回國人員創(chuàng)新專項資助

崔天盆（1967年-）,男,博士,副主任技師,主要從事臨床免疫學(xué)研究,E-mail:Tianpencui@hotmail.com。