曲古抑菌素A對神經膠質瘤細胞NOS1基因轉錄的影響

李英慧，李春義，陳芳杰，趙彥艷

（中國醫科大學 基礎醫學院醫學遺傳學教研室，沈陽 110001）

曲古抑菌素A對神經膠質瘤細胞NOS1基因轉錄的影響

李英慧，李春義，陳芳杰，趙彥艷

（中國醫科大學 基礎醫學院醫學遺傳學教研室，沈陽 110001）

目的 以曲古抑菌素A（TSA）為乙酰化作用因素，研究大鼠神經膠質瘤C6細胞中乙酰化對神經型一氧化氮合酶（NOS1）基因轉錄水平的影響。方法 應用real-time RT-PCR方法檢測C6細胞中NOS1基因mRNA在不同時間及不同濃度TSA作用下表達水平的變化；采用nuclear run-off實驗檢測TSA作用下NOS1基因轉錄效率的改變。結果 TSA以時間及濃度依賴方式上調C6細胞中NOS1mRNA水平；NOS1基因轉錄效率在TSA作用下顯著提高。結論 TSA引起的乙酰化使C6細胞中NOS1基因轉錄水平明顯增加。

NOS1；TSA；乙酰化

一氧化氮（nitric oxide，NO）在神經系統中具有多種不同的功能。神經型一氧化氮合酶（NOS1）在神經系統的NO合成中發揮重要作用［1］。NOS1基因轉錄水平的調節可動態調節NOS1蛋白的表達及NO的合成。蛋白質乙酰化在基因轉錄調控中發揮重要作用。曲古抑菌素A（TSA）是一種組蛋白去乙酰化酶抑制劑，可引起多種蛋白質的乙酰化［2］，從而調節基因表達。本研究以TSA作為刺激因素，探索乙酰化對大鼠神經膠質瘤C6細胞中NOS1基因轉錄水平的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞培養

C6細胞培養于含15%胎牛血清的DMEM培養基中。37℃，5%CO2及飽和濕度的條件下培養。

1.2 RNA提取及real-time RT-PCR

將細胞隨機分為2組，一組用濃度分別為0、2.5、25、250和 2500ng/ml TSA處理 24h，另一組為濃度 250ng/ml TSA分別作用 0、6、12、24及 48h，分別收集2組細胞。應用TRIzol試劑常規方法提取細胞總RNA，采用反轉錄試劑盒（美國Promega公司）合成cDNA。NOS1引物及Taqman探針序列：上游5′-AGGAGGACGCTGGTGTATTC-3′，下游 5′-ATCTAAGGCGGTTGGTCACT-3′，Taqman 探針：5′Fam-ACCGGTTGTCATCCCTCAGCCT-3′Tamra；同時，βactin作為內參，應用如下引物及探針進行擴增：上游 5′-AGCAGATGTGGATCAGCAAG-3′，下游 5′-AACAGTCCGCCTAGAAGCAT-3′，Taqman 探 針 ：5′Fam-CCCTCCATCGTGCACCGCAA-Tamra 3′。PCR在優化的反應條件下進行。采用相對定量方法，每個樣品擴增3次，取平均值作為樣品的相對表達量。

1.3 Nuclear run-off實驗

收集對照及TSA（250ng/ml）刺激24h的C6細胞，裂解細胞。獲得的細胞核重懸于甘油貯存液，并立即置于-70°C凍存待用。制備含人NOS1或βactin cDNAs的pMD18-T載體，并用Hind III酶切線性化、0.2mol/LNaOH變性，作為探針交聯于尼龍膜上。將制備好的細胞核孵育在含100μCi［α-32P］UTP的反應緩沖液中，30°C，30min，進行體外轉錄。反應混合物用DNase I及蛋白酶K處理，酚/氯仿抽提，乙醇沉淀獲得RNA。合成的RNA與尼龍膜45°C雜交48h，2×SSC洗膜3次，放射自顯影。以βactin信號為內對照，分析TSA刺激前后NOS1信號強弱變化。

2 結果

2.1 TSA以時間和濃度依賴方式上調C6細胞中NOS1基因mRNA表達

細胞經不同濃度TSA作用24h，NOS1mRNA水平逐漸上升；當細胞經250ng/ml TSA作用不同時間，24hNOS1mRNA達到最高水平 （圖1）。因此，TSA引起的乙酰化能夠以時間及濃度依賴方式上調NOS1mRNA表達。

2.2 TSA使C6細胞NOS1mRNA轉錄效率提高

為進一步確定上述NOS1mRNA水平的增加是否由轉錄效率的提高而引起，我們同時進行了nuclear run-off實驗。提取對照組和TSA刺激組的細胞核，在32P標記的UTP存在條件下進行體外轉錄。新合成的mRNA與含人NOS1或β-actin cDNAs的pMD18-T質粒探針進行雜交。在TSA作用下，βactin的轉錄無明顯改變，而NOS1的轉錄效率顯著提高（圖2）。因此，TSA引起的NOS1mRNA表達水平的上調與其轉錄效率的改變一致。

3 討論

組蛋白乙酰轉移酶（HAT）和組蛋白去乙酰化酶（HDAC）是調節蛋白質乙酰化水平的兩類酶。這兩類酶的平衡對于維持蛋白質恰當的乙酰化水平至關重要。一旦平衡破壞將產生異常的蛋白質乙酰化或去乙酰化，并可導致多種神經系統疾病。因此，很多治療策略集中在對蛋白質乙酰化狀態的調節。新近的研究發現許多HDAC抑制劑可特異性抑制HDAC的作用，并在轉錄過程中募集HAT，從而引起蛋白質乙酰化，而對多種基因表達水平產生影響，具有多種潛在的臨床應用價值［3］。曲古抑菌素A（TSA）是一種鏈霉素生成物，1990年Yoshida等［10］首先報道了它在體內及體外條件下能夠特異性抑制去乙酰化酶的作用，從而引起蛋白質乙酰化。例如，它能夠通過抑制HDAC6的作用而上調α-微管蛋白的乙酰化水平，從而彌補Huntington′s病中基于微管的運輸缺陷［4］。因此，本研究就選擇了TSA作為刺激因素。

NO由一氧化氮合酶（NOS）催化產生，它共有3種亞型，即神經型（NOS1）、誘導型（NOS2）和內皮型（NOS3）。研究發現HAT及HDAC是NOS基因表達的調節因子。例如，HDAC的抑制可增強結合在NOS3近端啟動子的H3、H4組蛋白乙酰化水平，從而引起其mRNA表達水平上調［5］。NOS1在神經系統中尤為重要，并與多種神經系統疾病相關［6］。本研究中我們以TSA為乙酰化作用因素，檢測乙酰化對神經膠質瘤C6細胞中NOS1基因表達水平的影響。我們的結果顯示TSA能夠以時間和濃度依賴方式上調NOS1基因mRNA表達水平，這提示了乙酰化參與了NOS1mRNA轉錄水平的調節。Nuclear run-off實驗是一種檢測基因mRNA動態變化的方法，它可以排除mRNA半衰期等改變對mRNA水平的影響，因此我們進一步應用該方法檢測了NOS1轉錄效率的變化。結果發現TSA能夠上調NOS1轉錄效率，與mRNA水平的變化一致，證明了TSA引起的NOS1mRNA水平的增加至少部分是由于其轉錄效率的增加而引起的。

綜上，本研究結果證明TSA引起的乙酰化可使神經膠質瘤C6細胞中NOS1基因mRNA表達及NOS1轉錄效率增加，這有可能為研究某些NO相關的神經系統疾病的發病機制提供分子基礎并為其治療提供新的靶標，而關于TSA上調NOS1表達的確切分子機制仍有待進一步研究。

［1］Dawson TM，Dawson VL，Snyder SH.Anovel neuronal messenger molecule in brain：the free radical，nitric oxide.Ann Neur，1992，32（3）：297-311.

［2］Yoshida M，Kijima M，Akita M，et al.Potent and specific inhibition of mammalian histone deacetylase both in vivo and in vitro by trichostatin A.JBiol Chem，1990，265（28）：17174-17179.

［3］Tang YA，Wen WL，Chang JW，et al.ANovel Histone Deacetylase Inhibitor Exhibits Antitumor Activity via Apoptosis Induction，FActin Disruption and Gene Acetylation in Lung Cancer.PLoSOne，2010，5（9）.pii：e12417.

［4］Dompierre JP，Godin JD，Charrin BC，et al.Histone deacetylase 6inhibition compensates for the transport deficit in Huntington′s disease by increasing tubulin acetylation.JNeurosci，2007，27（13）：3571-3583.

［5］Gan Y，Shen YH，Wang J，et al.Role of histone deacetylation in cellspecific expression of endothelial nitric-oxide synthase.JBiol Chem，2005，280（16）：16467-16475.

［6］Chabrier PE，Demerle-Pallardy D，Auguet M.Nitric oxide synthases：targets for therapeutic strategies in neurological diseases.Cell Mol Life Sci，1999，55（8-9）：1029-1035.

（編輯 孫憲民，英文編輯 陳 姜）

Effect of Trichostatin AonNOS1Gene Transcription in Glioma Cells

LIYing-hui，LIChun-yi，CHENFang-jie，ZHAOYan-yan
（Department of Medical Genetics，College of Basic Medical Sciences，China Medical University，Shenyang 110001，China）

ObjectiveTo study the effect of acetylation on neuronal nitric oxide synthase（NOS1）gene transcription in rat glioma C6cells by using trichostatin A（TSA）as a treatment of acetylation.MethodsThe expression level ofNOS1mRNAin C6cells treated with different concentrations of TSAwas detected by real-time reverse transcription polymerase chain reaction at different time points.Nuclear run-off assay was performed to assess the changes in NOS1transcription rate in C6cells treated with TSA.ResultsTSAupregulatedNOS1mRNAexpression in a time-and concentration-dependent manner in C6cells.TSAincreased the transcription rate ofNOS1gene markedly.ConclusionTSA-induced acetylation may upregulateNOS1gene transcription in C6cells.

NOS1；trichostatin A；acetylation

R394

A

0258-4646（2010）11-0901-03

遼寧省教育廳高校科研基金資助項目（2008858）；國家自然科學基金資助項目（30900807）

李英慧（1976-），女，副教授，博士.

趙彥艷，E-mail：yyzhao@mail.cmu.edu.cn

2010-09-03