基質細胞衍生因子1在IgA腎病小鼠腎臟的表達及FTY720對其的影響

羅軍，王紫，周建華

（華中科技大學 同濟醫學院附屬同濟醫院兒科，武漢 430030）

基質細胞衍生因子1在IgA腎病小鼠腎臟的表達及FTY720對其的影響

羅軍，王紫，周建華

（華中科技大學 同濟醫學院附屬同濟醫院兒科，武漢 430030）

目的 探討基質細胞衍生因子1（SDF-1）在IgA腎病小鼠的表達以及FTY720對SDF-1表達的影響。方法 30只BALB/c小鼠，隨機分為3組，每組10只。IgA腎病模型組及FTY720治療組均采用黏膜免疫復合物法造模，第9周起對FTY720組給予FTY720干預，另設正常對照組。收集實驗第4、8、12周時尿液，檢測尿紅細胞及尿蛋白定量；第12周末處死動物留取腎臟，普通光鏡及免疫熒光法檢測腎臟病理改變，SABC法檢測腎臟SDF-1蛋白的表達，實時定量PCR技術分析腎臟SDF-1mRNA的表達差異。結果 模型組小鼠自8周后開始出現蛋白尿，腎臟呈現典型的系膜增殖性改變，FTY720干預組蛋白尿及腎小球病變較輕。SDF-1蛋白在正常小鼠及經FTY720干預小鼠腎臟組織均呈低表達，但在模型鼠腎臟組織中呈強陽性表達。SDF-1mRNA在模型組小鼠腎臟組織中的表達較正常組有所增加，而在經FTY720干預的小鼠腎臟組織中的表達則較模型組明顯減少。結論 SDF-1可能作為IgA腎病腎臟損傷及腎間質纖維化的一項指標存在。FTY720對IgA腎病具有良好的治療效果，它可能通過影響SDF-1在腎臟的表達發揮治療作用。

基質細胞衍生因子1；IgA腎病；FTY720；小鼠

基質細胞衍生因子1（stromal cell-derived factor-1，SDF-1）是歸屬于CXC趨化因子家族的一種趨化因子，在腎臟可持續性表達，近年來的研究表明其與受體CXCR4所形成的SDF-1/CXCR4軸在慢性腎臟疾病的發病及進展等方面扮演重要角色，但作用機制尚未明確。FTY720是一種新合成的具有很強的免疫調節活性的免疫抑制劑，在慢性抗thy-1腎小球硬化模型及單側輸尿管梗阻模型中，可以明顯抑制腎間質纖維化，延緩腎小球硬化進程［1，2］。本研究通過使用FTY720對小鼠IgA腎病模型進行干預，觀察了FTY720對IgA腎病小鼠的預防及治療效果，探討了SDF-1在IgA腎病小鼠的表達狀況以及FTY720對其的影響，以期為IgA腎病的靶向治療提供新的方向。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物分組和處理：BALB/c小鼠30只，雌性，體質量18～20g（華中科技大學同濟醫學院動物實驗中心提供），隨機分為正常對照組、IgA腎病模型組、FTY720治療組，每組10只。模型組及FTY720治療組均建立IgA腎病模型，采用隔日0.4ml 0.1%牛血清白蛋白（BSA）酸化水（6mmol/L鹽酸）灌胃，第6周定時尾靜脈注射1%BSA緩沖液（0.4ml/只，每日1次，連續3d），第9周起尾靜脈注射葡萄球菌腸毒素B，劑量為0.4mg/kg/周，每周1次，連續3周。FTY720治療組自第9周起同時給予0.5mg/kg·d-1的FTY720水溶液灌胃，共4周，其他處理同模型組。對照組自由進食、飲水。12周末為實驗終點，處死動物，收集腎臟組織備用。

1.1.2 儀器與試劑：PRISM7000HTRealTime RTPCR擴增儀（ABI公司）；FTY720（Cayman公司）；SybryGreen RealTime RT-PCR試劑盒（大連寶生物工程有限公司）；SDF-1引物（上海英駿生物技術有限公司合成）；兔抗小鼠SDF-1抗體（北京博奧森生物技術有限公司）；SABC試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 24 h尿蛋白定量：于實驗第4、8、12周末時將各組小鼠置代謝籠，收集24h尿液，采用考馬斯亮藍法檢測尿蛋白定量。

1.2.2 尿紅細胞計數：上述收集尿液標本同時采用定量尿沉渣計數法檢測尿紅細胞數。

1.2.3 腎臟常規病理學檢查：小鼠處死后即留取腎皮質，10%中性甲醛固定，石蠟包埋，切片厚3～4μm，常規脫蠟入水，行 HE、PAS、Masson 及 PASM染色，光鏡下觀察腎臟基本病理改變情況。

1.2.4 腎組織IgA免疫熒光檢測：留取新鮮腎皮質標本，冰凍切片后采用FITC標記的羊抗兔IgG及兔抗小鼠IgA對腎切片行間接免疫熒光法檢查。

1.2.5 免疫組織化學檢測SDF-1的表達：腎臟石蠟切片，厚3～4μm，常規脫蠟并經抗原修復。一抗為兔抗小鼠SDF-1多克隆抗體，二抗為羊抗兔SABC試劑盒，采用SABC法檢測腎組織中SDF-1的表達，陽性部位呈棕黃色。

1.2.6 定量PCR技術檢測腎臟SDF-1mRNA的表達：提取腎組織中的總RNA，逆轉錄合成cDNA，采用Realtime RT-PCRSybryGreen染料法對組織中SDF-1模板進行擴增，并使用2-ΔΔCt法計算初始mRNA的相對值，分析基因表達差異。管家基因GAPDH作為組內參基因，各樣本的ΔCt=Ct（目的基因）-Ct（內參基因），ΔΔCt=ΔCt（目標組）-ΔCt（對照組）。SDF-1引物序列：5′GCTCTGCATCAGTGACGG3′（正義鏈），5′TAATTACGGGTCAATGCACA3′（反義鏈）。GAPDH引物序列：5′CTGCACCACCAACTGCTTAG3′（正義鏈），5′GATGGCATGGACTGTGGTCAT3′（反義鏈）。

1.3 統計學分析

采用SPSS13.0統計軟件包行t檢驗，計量資料數據用±s表示，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 24h尿蛋白定量檢測及血尿檢測結果

各組小鼠尿蛋白定量于觀察第4周末時未見統計學差異，自8周末始模型組小鼠尿蛋白較正常對照組開始增加，12周末時達高峰；經FTY720干預的小鼠尿蛋白定量于8周末及12周末時均增加，但低于模型組，且差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。實驗周期內各組小鼠均未見肉眼血尿，模型組小鼠可見8例（80%）鏡下血尿，FTY720治療組可見3例（30%）鏡下血尿，對照組各期均未見血尿。

表1各組小鼠24h尿蛋白定量（n=10，mg/24h，±s）Ta b.124-h o u r u r i n ep r o t e i ni nmi c eo f e a c hg r o u p（n=10，mg/24h，±s）Group Week 4 Week 8 Week 12Control 0.79±0.06 0.87±0.07 0.81±0.071）IgANmodel 0.87±0.09 1.16±0.11 2.07±0.17FTY720 0.89±0.07 1.12±0.14 1.35±0.111）1）P＜ 0.05vs IgANmodel group.

2.2 腎組織常規病理學檢測結果

正常組小鼠腎小球均未見明顯變化，模型鼠呈現典型的系膜增生性腎炎病變，系膜基質多呈中重度增生，部分腎小球肥大，腎小囊上皮細胞小管樣化生，并可見球囊粘連。FTY720治療組腎小球系膜增殖性改變明顯較輕。見圖1。

2.3 腎組織IgA免疫熒光檢測結果

新鮮腎皮質標本冰凍切片后，采用FITC標記的羊抗兔IgG及兔抗小鼠IgA對腎切片行間接免疫熒光法檢查，可見模型組及FTY720治療組IgA呈團塊狀沉積于系膜區，模型組熒光強度達（++++）。

2.4 腎組織中SDF-1免疫組化檢測結果（圖2）

SDF-1蛋白在正常小鼠腎臟組織中呈低表達狀態，在模型組腎臟組織中呈強陽性表達，在經FTY720干預小鼠腎臟組織呈低表達。正常小鼠及FTY720干預小鼠腎臟組織中SDF-1蛋白陽性表達主要出現在腎小管上皮細胞，模型組腎小球亦可見少量表達，而在各組小鼠腎間質均缺乏表達。

2.5 腎組織中SDF-1mRNA檢測結果

令正常對照組小鼠腎臟組織中SDF-1的初始模板基因表達量為1，使用2-ΔΔCt法計算出模型組及FTY720處理組小鼠腎臟SDF-1的初始模板相對表達平均值分別為1.54及1.07（表2）。可見SDF-1mRNA在模型組小鼠腎臟組織中的表達較正常組有顯著增加（P＜0.05），而在經FTY720干預的小鼠腎臟組織中的表達則較模型組明顯減少（P＜0.05）。

表2各組小鼠SDF-1初始模板基因相對表達量（n=10，±s）Ta b.2Re l a t i v e e x p r e s s i o n l e v e l o fSDF-1mRNAi n mo u s e k i d n e y（n=10，±s）Group ΔCT ΔΔCT 2-ΔΔCt Control 4.86±0.26 0 1IgANmodel 4.24±0.34 －0.62±0.08 1.54±0.181）FTY720 4.76±0.35 -0.10±0.05 1.07±0.162）1）P＜0.05vs control group；2）P＜0.05vs IgANmodel group.

3 討論

本研究參照經典方法制做小鼠IgA腎病模型［3，4］，結果出現典型的蛋白尿及IgA腎病病理改變，說明模型制作較為成功。與此同時，本研究通過免疫組化技術檢測了SDF-1蛋白在各組小鼠腎臟的表達，發現SDF-1在正常小鼠腎小管上皮細胞呈低表達狀態，在模型組腎小管則呈強陽性表達，而在腎間質各組小鼠均缺乏陽性表達，這與Loten［5］用免疫組織化學檢測IgA腎病患者腎臟SDF-1表達的結果相似。通過熒光實時定量PCR技術，本研究進一步發現模型組小鼠SDF-1mRNA在腎臟中的表達增加，與免疫組化檢測結果吻合，與國內外一些學者對其他慢性腎臟疾病如狼瘡性腎炎、慢性缺氧導致腎硬變等的研究結果相似［6，7］。Gao［8］在動物模型中發現同種腎移植后12周，單用環孢素A組的SDF-1水平是用環孢素A+抗SDF-1抗體組的2倍，是正常對照的4倍，故推測SDF-1是慢性腎臟疾病腎臟損傷程度的一項指標，SDF-1表達越高，腎臟損傷程度越重。

本研究中采用FTY720進行干預的小鼠蛋白尿及病理改變均較模型組小鼠明顯減輕。此外，在經FTY720干預的小鼠腎臟組織中，SDF-1蛋白僅有微量表達；熒光實時定量PCR技術亦證實SDF-1mRNA在腎臟的表達較模型組小鼠有明顯減少。目前一般認為FTY720主要通過非選擇性作用于淋巴細胞表面的1-磷酸鞘氨醇受體，將淋巴細胞阻滯在次級淋巴器官，使其不能加入全身循環而發揮其免疫抑制效應［9］。由于SDF-1是淋巴細胞的強趨化因子，在腎臟表達增高可以驅動淋巴細胞包括IgA分泌細胞向腎臟分布，最終導致腎臟局部的炎性反應和損傷。

本研究結果表明，FTY720對小鼠IgA腎病具有良好的預防及治療效果，它可能通過上述機制發揮作用，同時也可能因減少趨化因子SDF-1在腎臟的表達，進而影響相關黏附分子的表達以及相互作用，最終進一步減少淋巴細胞向小管間質的浸潤，減輕淋巴細胞所分泌的淋巴因子和炎性介質對腎臟組織的損傷，延緩了腎臟纖維化的進程，從而達到治療作用。而FTY720如何作用于趨化因子SDF-1，以及與其他相關黏附分子相互作用關系亦有待進一步研究。

綜上所述，FTY720的治療作用可能通過減少SDF-1在腎臟的表達而發揮，以SDF-l/CXCR4為靶向的研究將可能為IgA腎病及其他慢性腎臟病的治療提供新的思路。

［1］Peters H，Martini S，Wang Y，et al.Selective lymphocyte inhibition by FTY720slows the progressie course of chronic anti-thy1glomerulosclerosis［J］.Kidney Int，2004，66（4）：1434-1443.

［2］謝敏，周建華.FTY720對大鼠腎間質纖維化的抑制作用［J］.華中科技大學學報（醫學版），2007，36（6）：751-755.

［3］劉志紅，黎磊石，李莉.葡萄球菌腸毒素誘發的IgA腎病模型［J］.中華腎臟病雜志，1989，5（1）：6-10.

［4］劉宏偉，盧景芬，李彩熙，等.滋腎止血片對實驗性IgA腎病小鼠腎組織氧自由基的影響［J］.中國中醫基礎醫學雜志，1996，2（6）：24-26.

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［7］Kretzler M，Grne HJ，Schlndorff D，et a1.Human nephrosclerosis triggers a hypoxia-related glomerulopathy［J］.Am JPathol，2009Dec 17.［Epub ahead of print］

［8］Gao C，Huan J.SDF-1plays a key role in chronic allograft nephropathy in rats［J］.Transplant Proc，2008，40（5）：1674-1678.

［9］Chiba K，Yanagawa Y，Masubuchi Y，et a1.FTY720，a novel immunosuppres-sant，induces sequestration of circulating mature lymphocytes by acceleration of lymphocyte homing in rats.1.FTY720selective lydecreases the number of circulating mature lymphocytes by acceleration of lymphocyte homing［J］.JImmunol，1998，160（10）：5037-5044.

（編輯 王又冬，英文編輯 陳 姜）

Effect of FTY720on the Expression of Stromal Cell-derived Factor-1in Mouse Model of IgANephropathy

LUOJun，WANGZi，ZHOUJian-hua
（Department of Pediatrics，Tongji Hospital，Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430030，China）

ObjectiveTo study the effect of FTY720on the expression of stromal cell-derived factor-1（SDF-1）in mouse model of IgAnephropathy （IgAN）.MethodsAtotal of 30female BALB/c mice were randomly divided into 3groups （n=10each group）：control group，IgANmodel group，and FTY720group.The 24-hour urine protein was quantified by coomassie brilliant blue at weeks 4，8，and 12.All the mice were killed after 12weeks，and the kidneys were sampled.The pathological changes in the kidney were observed under light microscope and detected by immunofluorescence.The levels of SDF-1protein and mRNAin the kidney were detected by SABCimmunohistochemical method and real-time reverse transcription polymerase chain reaction，respectively.ResultsProteinuria and mesangial cell proliferation were observed in IgANmodel group since week 8，and these pathological changes were less severe in FTY720group.The expression level of SDF-1protein was low in control and FTY720groups，but strongly positive expression of SDF-1protein was found in IgANgroup.The expression ofSDF-1mRNAin IgANmodel group increased，compared with control group.The expression ofSDF-1mRNAwas lower in FTY720group than in IgANmodel group.ConclusionSDF-1might be an indicator of renal injury and fibrosis of IgAN.FTY720has a good therapeutic effect on IgANby affecting the expression ofSDF-1in the kidney.

stromal cell-derived factor-1；IgAnephropathy；FTY720；mouse

R692.6

A

0258-4646（2010）11-0895-03

國家自然科學基金資助項目（30872797）

羅軍（1973-），男，主治醫師，博士研究生.

周建華，E-mail：jhzhou@tjh.tjmu.edu.cn

2010-08-03

·論著·