精子發生障礙患者Y染色體微缺失的檢測

孔琳，潘伯臣，杜強，楊大磊

（中國醫科大學 附屬盛京醫院婦產科生殖中心，沈陽 110004）

精子發生障礙患者Y染色體微缺失的檢測

孔琳，潘伯臣，杜強，楊大磊

（中國醫科大學 附屬盛京醫院婦產科生殖中心，沈陽 110004）

目的 探討Y染色體微缺失與精子發生障礙患者染色體核型、臨床表型、性激素水平等因素的關系。方法 采用多重PCR技術檢測42例非梗阻性無精子癥及39例嚴重少精子癥患者的SRY基因、ZFY基因及AZFa、AZFb和AZFc3個區域的6個序列標簽位點。結果 81例非梗阻性無精子癥及嚴重少精子癥患者中發現了10例微缺失，發生率12.35%，其中非梗阻性無精子癥患者6例，嚴重少精子癥患者4例；10例微缺失患者中，1例為AZFa+AZFb+AZFc區缺失，2例為AZFb+AZFc區缺失，1例為AZFb區缺失，6例為AZFc區缺失。結論 Y染色體長臂微缺失與精子發生障礙相關，有必要對非梗阻性無精子癥及嚴重少精子癥患者進行Y染色體微缺失檢測。

男性不育；無精子因子；Y染色體微缺失；多重聚合酶鏈反應；無精子癥；嚴重少精子癥

全世界大約有15%的夫婦不育，其中男性不育約占40%～50%，因此男性不育越來越引起廣泛重視［1］。精子發生障礙是男性不育的一個重要病因，可由多方面因素引起，例如疾病、內分泌紊亂、遺傳因素、環境因素等。但目前大約60%患者中睪丸生精功能下降的原因人們還未確切了解。

近十幾年來的研究表明，Y染色體上存在著一些精子發生調控基因，即無精子因子（azoospermia factor，AZF），AZF缺失引起的生精障礙是導致男性不育的重要原因。本研究采用多重PCR，對非梗阻性無精子癥和重度少精子癥患者進行Y染色體微缺失檢測，分析AZF缺失類型與患者臨床表型之間的關系，以期為AZF缺失相關男性不育的臨床診斷和治療提供有益資料和指導。

1 材料與方法

1.1 研究對象

81例患者均為2006年3月至2007年10月于中國醫科大學附屬盛京醫院輔助生殖中心門診就診的患者，年齡23～40歲。詳細了解患者有無睪丸炎、腮腺炎、精索靜脈曲張等病史，排除梗阻性無精子癥，所有患者均無有毒物質及放射線接觸史。按WHO（1999）的診斷標準，進行2次以上的精液常規分析，將患者分為外梗阻性無精子癥（42例）和嚴重少精子癥（精子密度＜5×106/ml，39例）。所有患者均排除常染色體核型異常，其中2例染色體核型為46，XY（大 Y），1例為 46，XY（小 Y）。所有患者均在上午8：00～10：00靜脈采血進行血清性激素測定，包括卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone，FSH）、黃體生成素（luteinizing hormone，LH）和睪酮（testosterone，T）。

1.2 方法

1.2.1 外周血DNA提取：抽取受試對象靜脈血2 ml，EDTA抗凝。所有樣本的DNA用杭州博日科技有限公司的Biospin全血基因組DNA提取試劑盒提取。提取的DNA用紫外分光光度計測吸光度并計算DNA濃度。

1.2.2 引物：確定Y染色體AZF區域內的6個序列標簽位點（sequence tag site，STS），分別是AZFa區的sY86（320bp） 和 sY84（326bp）、AZFb區域內的sY127（274bp）和 sY134（301bp）、AZFc區域內的sY254（400bp）和 sY255（126bp）。6對引物均由Invitrogen公司所合成。引物序列均已發表［2］。

1.2.3 質控：設立ZFY及SRY基因作為內對照，其引物序列已發表［2］。同時設立已生育的正常男性為陽性對照、正常女性作為陰性對照、水作為空白對照。每個標本檢測需做2個多重PCR反應。為排除假陽性反應，對發現有微缺失的標本進行3次多重PCR檢測，如果上述缺失仍無擴增信號，而SRY和ZFY均能正常擴增，則證實微缺失的存在；必要時，使用相應引物進行單重PCR擴增予以確認。

1.2.4 PCR檢測：PCR反應總體系為 20μl，包括去離子水、緩沖液、dNTP、DNA聚合酶及模板。按下列條 件 擴 增 ：94℃ ，4min；95℃ ，1min；56℃ ，1min；72℃，1min；共 35個循環，72℃延伸 7min，最后置4℃保溫。

1.2.5 電泳檢測：取PCR擴增產物7μl，加10×loading buffer 1μl，在3.5%的瓊脂糖凝膠上電泳，紫外燈下觀察分析。Y染色體微缺失者相應條帶的PCR產物闕如。

1.2.6 DNA測序：所有PCR產物均經北京華大公司進行測序，證實了檢測結果的特異性。

2 結果

2.1 多重PCR電泳所示Y染色體微缺失檢測結果

81例患者中10例患者檢測到微缺失，總發生率為12.35%。其中，42例非梗阻性無精子癥中有6例存在微缺失，發生率為14.29%；39例嚴重少精子癥患者中4例檢測到微缺失，發生率為10.26%。10例微缺失患者中，1例為AZFa+AZFb+AZFc區（占總缺失率10.00%），2例為AZFb+AZFc區（占總缺失率 20.00%），1例為AZFb區（占總缺失率10.00%），6例為AZFc區（占總缺失率60.00%）。見圖1。

如果多重PCR檢測結果為陽性（即有缺失），我們通常使用相應引物進行單重PCR擴增予以確認，以排除假陽性反應。結果發現，目的條帶為sY225的擴增產物（126bp）。見圖2。

2.2 Y染色體微缺失患者AZF缺失類型及其表型

在臨床表型的調查中，失訪或拒絕提供染色體及睪丸大小等資料患者4人。其余6例微缺失患者中，4例睪丸體積小于正常值（12ml），1例患有隱睪及鞘膜積液，1例患有左精索靜脈曲張和左側睪丸鞘膜積液。6例AZF缺失患者的內分泌激素平均值分別為FSH19.42mIU/ml（參考值1.27～19.26mIU/ml），LH5.38mIU/ml（參考值 1.24～8.62mIU/ml），T3.74ng/ml（參考值1.75～7.81ng/ml）。81例患者中，2例染色體核型為46，XY（大Y），均未見缺失；1例染色體核型為46，XY（小Y）的患者AZFb+AZFc區缺失。具體臨床表型見表1。

3 討論

表1Y染色體微缺失患者AZF缺失類型及其臨床表型Ta b.1Cl i n i c a l f e a t h u r e a n d AZFd e l e t i o n p h e n o t y p e s o f t h e p a t i e n t s w i t h Yc h r o mo s o me mi c r o d e l e t i o n No.Azoo/Oligo Testis volume Chromosome FSH LH T Deletion left/right（ml）karyotype（mIU/ml）（mIU/ml）（ng/ml）type 2 Azoo - 46，XY - - - AZFc 8 Oligo 6/6 46，XY 12.69 9.00 3.25 AZFc 27 Oligo Hydrocele testis 46，XY 33.76 7.02 4.59 AZFc 56 Oligo 7/6 46，XY 8.11 2.57 2.23 AZFc 60 Oligo - 46，XY - - - AZFc 65 Azoo 8/10 46，XY 11.73 3.46 3.75 AZFc 34 Azoo - 46，XY - - - AZFb 80 Azoo 6/6 46，XY（short Y） 33.04 6.44 3.78 AZFb+AZFc Normal size 82 Azoo left varicocele 46，XY 17.23 3.78 4.85 AZFb+AZFc Left hydrocele testis 55 Azoo - 46，XY - - - AZFa+AZFb+AZFc Oligo，severe oligospermia；Azoo，azoospermia.

1976 年，Tiepolo和Zuffardi發現在無精子癥患者中存在顯微鏡下可見的Y染色體長臂的缺失，推測Y染色體長臂上可能存在著控制精子生成的基因，并稱其為AZF。隨著分子生物學及遺傳學等學科的發展，人們對AZF結構、功能以及與男性不育之間關系的認識逐漸加深。1986年，Vergnaud初步建立了人類Y染色體缺失圖譜；1996年，Voget等將AZF劃分為3個無重疊區域，分別命名為AZFa、AZFb和AZFc；2002年，Repping又提出新的AZFb和AZFc分區與缺失模型［3］。

近十幾年來，國內外很多實驗室都相繼開展了關于Y染色體微缺失的檢測。Y染色體AZF總的缺失率在不同國家、不同種族之間存在明顯差異，從1%～55%不等［4］。周友泉等總結中國無精癥和少精癥Y染色體微缺失的總缺失率為15.05%［5］。AZF不同區域的缺失率也不盡相同，其中AZFc區缺失率最高，AZFa區缺失率最低。在研究對象的選擇上，大部分學者都集中在對原發性無精子癥及少精子癥進行研究，有的實驗室則專門對準備接受胞漿內單精子注射技術 （intracytoplasmic sperm injection，ICSI）治療的不育患者進行檢測。綜合來看，AZF缺失率的差異主要與研究對象的選擇、STS位點的選擇與數量、實驗設計的規范性等因素有關。近年來，Simoni等提出的多重PCR檢測方案受到歐洲男科學協會和歐洲分子遺傳實驗質控協作網的推薦，得以廣泛應用；該法被認為可檢出95%以上的Y染色體微缺失［2］。本研究采用該方法，并對多重PCR產物進行了測序確認。在此基礎上，我們檢測了81例非梗阻性無精子癥和嚴重少精子癥患者，發現這組人群中AZF缺失總的發生率為12.35%。其中，非梗阻性無精子癥患者中微缺失的發生率為14.29%；嚴重少精子癥患者中微缺失的發生率為10.26%。就缺失類型而言，最多見的是AZFc區缺失，占60%；其次為AZFb+AZFc區缺失，占20%；其余類型為AZFa+AZFb+AZFc區和AZFb區，各占10%，檢測結果與國內外大部分研究報道的相似。

Y染色體微缺失類型與臨床表型的關系尚不完全清楚。目前認為，AZFa缺失導致唯支持細胞綜合征；AZFb或AZFb+AZFc的缺失導致唯支持細胞綜合征或生精阻滯。以上類型缺失臨床上均表現為無精子，睪丸中也無精子存在，因此，不推薦患者進行睪丸取精或ICSI治療。而AZFc缺失的患者臨床表現多樣，從無精子到嚴重少精子，甚至接近正常精子數；而且，無精子癥患者的睪丸內仍有發現精子的可能，可通過ICSI助孕獲得后代，但AZFc區缺失也將同時遺傳給其男性后代［2］。本研究結果中，1例AZFa+AZFb+AZFc、2例AZFb+AZFc及 1例AZFb區缺失的患者均表現為無精子癥，而AZFc區缺失的6例患者中2例表現為無精子癥，4例表現為嚴重少精子癥，支持上述研究結論。

染色體 46，XY（大 Y）及 46，XY（小 Y）曾被認為是染色體正常核型的變異。但近年來大Y及小Y染色體對生殖方面的影響已經越來越受到國內外的關注。Nagvenkar等研究了88位欲行ICSI治療的不育患者，檢測出染色體變異率為37.5%，其中小Y染色體是性染色體變異的最常見類型［1］。黃海燕等總結了117例大小Y染色體臨床病例，認為Y染色體的變異均會不同程度地影響臨床表現［6］。Blanco等認為Y染色體長臂DNA序列的重復復制會影響其有關精子分化和發育的基因正常表達，造成精子受精障礙或影響精子受精能力而導致流產頻率增高［7］。大Y染色體可能是由于其異染色質區DNA過度重復而影響生殖細胞在減數分裂時染色體配對聯會，使受精卵分化、分裂異常；而小Y染色體則可能是由于Y染色質部分或完全丟失或排列過度緊密而影響其基因的功能發揮［6］。本研究中，2例染色體核型 46，XY（大 Y）患者均未見缺失，而 1例 46，XY（小Y）患者為AZFb+AZFc區缺失，提示小Y導致精子生成障礙可能與Y染色體長臂遠端的部分基因缺失有關。但本研究病例數較少，仍需進一步擴大樣本量進行檢測。

目前我國很多生殖中心都相繼開展了Y染色體微缺失的檢測項目。這項檢測既為男性不育癥提供了重要的病因學線索，又為非梗阻性無精子癥患者睪丸穿刺或活檢獲取精子的結局提供一定的預測，從而使患者避免了不必要的手術創傷和經濟負擔。同時，由于開展了Y染色體微缺失檢測項目，我們能夠為一些患者提供個性化咨詢與治療。例如，有研究表明，AZFc缺失的患者可能出現精子數量隨時間進行性減少的現象［8］；對這樣的患者應該指導盡早接受治療促其配偶懷孕，或采取凍存精子的方法以備將來的不育治療。此外，AZF缺失檢測還可以和種植前遺傳學診斷等方法結合起來，避免AZF缺失患者將遺傳缺陷傳給其后代。

［1］Nagvenkar P，Desai K，Hinduja I，et al.Chromosomal studies in infertile men with oligozoospermia and non-obstructive azoospermia［J］.Indian JMed Res，2005，122（1）：34-42.

［2］Simoni M，Bakker E，Krausz C.EAA/EMQNbest practice guidelines for molecular diagnosis of Y-chromosomal microdeletions，State of the art 2004［J］.Int JAndrol，2004，27（4）：240-249.

［3］Repping S，Skaletsky H，Lange J，et al.Recombination between palindromesP5andP1onthehumanYchromosomecausesmassivedeletions and spermatogenic failure［J］.Am JHum Genet，2002，71（4）：906-922.

［4］Mittal RD，Singh G，Srivastava A，et al.Ychromosome micro-deletions in idiopathic infertility from Northern India ［J］.Ann Genet 2004，47（4）：331-337.

［5］周友泉，王厚照，劉芳，等.男性不育患者Y染色體AZF區域微缺失的 STS位點分析［J］.實用醫技雜志，2006，13（14）：2432-2434.

［6］黃海燕，張香改，高羽，等.117例大小Y染色體臨床意義分析［J］.中國計劃生育學雜志，2007，136（2）：105-107.

［7］Blanco P，Shlumukova M，Sargent CA，et al.Divergent outcomes of intrachromosomal recombination on the human Ychromosome：male infertility and recurrent polymorphism ［J］.JMed Genet，2000，37（10）：752-758.

［8］Vogt PH.Genomic heterogeneity and instability of the AZFlocus on the human Ychromosome［J］.Mol Cell Endocrinol，2004，224（1-2）：1-9.

（編輯 陳 姜，英文編輯 鄭華川）

Detection of YChromosomal Microdeletions in Patients with Spermatogenic Failure

KONGLin，PANBo-chen，DUQiang，YANGDa-lei
（Department of Obstetrics and Gynecology，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110004，China）

ObjectiveTo explore the relationship between Ychromosomal microdeletions and chromosome karyotype，clinical phenotypes and sex hormone levels in patients with spermatogenic failure.MethodsSRYgene，ZFYgene and 6sequence-tagged-sites inAZFa，AZFbandAZFcwere detected with multiplex polymerase chain reaction in 42non-obstructive azoospermic and 39severe oligozoospermic men.ResultsTen cases（12.35%）of microdeletions were found in 81non-obstructive azoospermic（6cases）or severe oligozoospermic patients（4cases）.Among the 10patients with Ychromosomal microdeletions，1had deletion ofAZFa+AZFb+AZFc，2AZFb+AZFc，1AZFband 6AZFc.ConclusionMicrodeletions in the long arm of Ychromosome were associated with spermatogenic failure.Screening for Ychromosomal microdeletions in azoospermic or severe oligozoospermic patients should be of necessity and significance.

male infertility；azoospermia factor；Ychromosomal microdeletions；multiplex PCR；azoospermia；severe oligozoospermi

R711.6

A

0258-4646（2010）01-0037-03

孔琳（1982-），女，醫師，碩士.

潘伯臣，E-mail：panpancmu@yahoo.com.cn

2009-07-01