一種新型可切削生物活性玻璃陶瓷的微核實驗

郝玉全，閻秀林，張旖驍，韓雪松，劉敏達，艾紅軍

（1.中國醫科大學 口腔醫學院口腔修復科，沈陽 110002；2.中國醫科大學 口腔醫學院口腔正畸科，沈陽 110002；3.中國醫科大學 第94期臨床醫學系，沈陽 110001；4.武警遼寧省總隊醫院 口腔科，沈陽 110034；5.中國醫科大學 第93期口腔醫學系，沈陽 110001）

一種新型可切削生物活性玻璃陶瓷的微核實驗

郝玉全1，閻秀林2，張旖驍3，韓雪松4，劉敏達5，艾紅軍1

（1.中國醫科大學 口腔醫學院口腔修復科，沈陽 110002；2.中國醫科大學 口腔醫學院口腔正畸科，沈陽 110002；3.中國醫科大學 第94期臨床醫學系，沈陽 110001；4.武警遼寧省總隊醫院 口腔科，沈陽 110034；5.中國醫科大學 第93期口腔醫學系，沈陽 110001）

目的 評價一種新型可切削生物活性玻璃陶瓷的潛在致突變性。方法 將30只N1H純系小鼠隨機等分為玻璃陶瓷組、陰性對照組和陽性對照組。玻璃陶瓷組將待測樣品制成粉末狀，用阿拉伯膠將其配成混懸液，以5g/kg的劑量經口灌胃；陰性對照組和陽性對照組分別灌注等體積的阿拉伯膠和環磷酰胺生理鹽水溶液（40mg/kg）。取小鼠骨髓細胞，油鏡下每只動物觀察1000個嗜多染紅細胞，并計算微核率。結果 玻璃陶瓷組、陰性對照組和陽性對照組的微核率分別為（1.31±0.53）‰、（1.32±0.62）‰和（29.20±0.74）‰，玻璃陶瓷組與陰性對照組的差異無統計學意義，與陽性對照組的差異有統計學意義（P<0.01）。結論該新型可切削生物活性玻璃陶瓷不引起小鼠骨髓細胞微核率增加。

玻璃陶瓷；微核實驗；致突變性

可切削生物活性玻璃陶瓷，由于可作為計算機輔助設計/計算機輔助制作（CAD/CAM）修復系統的原材料而具有廣闊的應用前景，倍受各國學者青睞。東北大學材料研究所近年來開發研制出一種新型的可切削生物活性玻璃陶瓷，該材料具有較低的熔化溫度、良好的可切削性能和較高的抗彎強度［1］，預期應用于口腔修復專業，作為CAD/CAM嵌體、冠、前牙固定橋及種植體的原材料。在臨床應用前，除必要的機械、理化性能研究外，還需進行生物安全性評估。本文從遺傳毒理學角度通過微核試驗評價其潛在致突變性，為其臨床應用進一步提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

將待檢測的可切削生物活性玻璃陶瓷（東北大學材料研究所提供）制成粉末狀，經高溫、高壓消毒后溶于阿拉伯膠，配成混懸液。主要試劑：甲醇（沈陽國藥集團化學試劑有限公司），Giemsa儲備液（自制），小牛血清（天津灝洋生物制品科技有限責任公司），pH6.8～6.98磷酸鹽緩沖液（自制）。主要儀器：BH2型光學顯微鏡（Olympus，日本）。

1.2 動物及分組

清潔級N1H純系小鼠30只（雌雄各半），體質量20～22g，由中國醫科大學實驗動物中心提供。將小鼠隨機等分為3組（每組雌雄各半）：玻璃陶瓷組，以5g/kg的劑量將制備好的生物陶瓷混懸液經口灌胃給藥；陰性對照組和陽性對照組分別灌注等體積的阿拉伯膠和環磷酰胺生理鹽水溶液（40mg/kg）。

1.3 嗜多染紅細胞（polychromatic erythrocyte，PCE）的染色及計數

24h后處死動物，剪取小鼠胸骨，除去血污和筋肉，剪去每節骨骺端并用小型的止血彎鉗擠出骨髓液，在載玻片上點于預先滴好的一小滴血清中，混勻后以推血片方法制成涂片，置于空氣干燥或用電吹風微熱吹干。將涂好風干的標本玻片放入染色缸中，用甲醇溶液固定15min，取出晾干。將固定晾干的涂片用Giemsa應用液（儲備液1份、pH6.8～6.98磷酸鹽緩沖液10份混合而成）染色10～15min后，迅速取pH6.8～6.89的磷酸鹽緩沖液，用滴管沖洗去染色液，置于片架晾干。

采用雙盲法閱片，先在低倍鏡下觀察，選擇細胞分布均勻、染色較好的區域，再在油鏡下觀察。嗜多染紅細胞經Giemsa染色后呈淡灰藍色，微核在胞質中呈深藍色的圓形或橢圓形，直徑相當于細胞直徑的1/20～1/5。每只動物觀察1000個PCE，并計算微核率。每只小鼠同時觀察并計算200個細胞中嗜多染紅細胞與正染成熟紅細胞的比值，即P/N比值。

1.4 統計學方法

應用統計軟件SPSS16.0對3組數據進行處理，各組微核率以±s表示，并采用SNK檢驗進行組間比較。

2 結果

2.1 各組小鼠PCE的微核率比較

玻璃陶瓷組與陰性對照組比較，小鼠PCE微核率未增加，差異無統計學意義（P>0.05）；但玻璃陶瓷組的PCE微核率明顯低于陽性對照組（P<0.01）。見表 1。

2.2 骨髓細胞鏡檢結果

玻璃陶瓷組與陰性對照組中含有微核的PCE極低，陽性對照組含有微核的PCE數量明顯增加（圖1）。

3 討論

根據ISO制定標準，牙科材料在用于人體之前必須完成一系列研究測試，以判斷此種材料的生物相容性。微核實驗是體內致突變性實驗，與染色體畸變實驗的吻合率高達88.7%，是一種快速簡潔的毒性檢測方法，可以代替染色體畸變實驗［2］，在檢測細胞毒性的同時可檢測出斷裂劑［3］，被認為是對斷裂劑反應的多個終端的檢驗［4］。在生物細胞研究中，微核實驗被用來證明化學物質對染色體的破壞力［5］，是評估染色體破壞的首選方法。因為它在確定染色體丟失和破壞方面可靠，可用于檢測生物材料可浸出成分的潛在致突變性［6］，現已成為檢測藥物、放射線、有毒物質的遺傳毒性，反映人體細胞或體外細胞遺傳學損傷的一個重要方法［7］。

骨髓細胞微核分析，主要是計算骨髓細胞中嗜多染紅細胞的微核出現率，從而判斷受試物的致突變性。陰性對照組的微核率一般應低于3‰，太高則應考慮本次試驗無效。本研究中陽性對照組灌注環磷酰胺40mg/kg時，微核率一般為22‰～30‰，說明本研究中動物的靈敏度均屬正常。材料組的微核率超過陰性對照組的2倍為陽性結果，只要低于陰性對照組的2倍均屬陰性結果［8］。本研究中玻璃陶瓷組微核率（1.31±0.53）‰，陰性對照組微核率（1.32±0.62）‰，陽性對照組微核率（29.20±0.74）‰，不僅符合以上評價標準，還可用統計學分析加以確認。研究結果表明，這種新型可切削生物活性玻璃陶瓷不引起小鼠骨髓細胞微核率增加。

此外，微核實驗中P/N比值的正常范圍為0.6～1.2，P/N比值<0.1表明PCE形成受到嚴重抑制，P/N比值<0.05表明受試物劑量過大，結果不可靠［9］。本研究中3組的P/N比值均在正常范圍內，表明實驗結果可靠。為避免假陰性結果的出現，本研究在預實驗的基礎上，將灌注劑量提高到5g/kg（ISO/TR7405推薦的灌注劑量為1g/kg）。

綜上，本研究從遺傳毒理學角度探索了新型CAD/CAM材料的生物相容性，為其臨床應用提供了理論依據，同時也為新產品開發奠定了基礎。

［1］秦小梅，修稚萌，左良，等.低熔可切削生物活性玻璃陶瓷的研究［J］.無機材料學報，2003，18（6）：1158-1162.

［2］Matsushima T，Hayashi M，Matsuoka A，et al.Validation study of the in vitro micronucleus test in a Chinese hamster lung cell line（CHL/IU）［J］.Mutagenesis，1999，14（6）：569-580.

［3］Kovalkovicova N，Sutiakove I，Kacmar P，et al.The importance of lymphocyte micronucleus test for the detection of genotoxic event［J］.Cent Eur JPublic Health，2000，8（4）：221-226.

［4］Kirsch-Volders M，Vanhauwaert A，De Boeck M，et al.Importance of detecting numerical versus structural chromosome aberrations［J］.Mutat Res，2002，504（1-2）：137-148.

［5］Fenech M.Biomarkers of genetic damage for cancer epidemiology［J］.Toxicology，2002，27（181-182）：411-416.

［6］寧麗，薛淼，黃哲瑋，等.醫用水凝膠PHEMA致突變性的系列實驗研究［J］.口腔材料器械雜志，1996，5（3）：109-111.

［7］杜峰濤，李林.細胞微核形成機理探討［J］.現代檢驗醫學雜志，2007，22（4）：19-22.

［8］陸華，孫皎，黃哲偉，等.微核試驗評價強化聚乙烯的潛在致突變性［J］.口腔材料器械雜志，1999，8（2）：68-69.

［9］王心如.毒理學實驗方法與技術［M］.北京：人民衛生出版社，2003：70-71.

（編輯 陳 姜，英文編輯 鄭華川）

Micronucleus Test of a New Machinable Bioactive Glass-ceramic Material

HAOYu-quan1，YANXiu-lin2，ZHANGYi-xiao3，HANXue-song3，LIUMin-da4，AIHong-jun1

（1.Department of Prosthodontics，School of Stomatology，China Medical University，Shenyang 110002，China；2.Department of Orthodontics，，School of Stomatology，China Medical University，Shenyang 110002，China；3.The 94th Class，Faculty of Clinical Medicine，China Medical University，Shenyang 110001，China；4.Department of Stomatology，Liaoning Province Corps Hospital of Chinese People’s Armed Police Forces，Shenyang 110034，China；5.The 93rd Class，School of Stomatology，China Medical University，Shenyang 110002，China）

ObjectiveTo evaluate the potential mutagenicity of a new machinable bioactive glass-ceramic material.MethodsThirty N1Hmouse inbred line（female：male=1：1）were divided to three groups at random（n=10），including glass-ceramic groups（oral administration of 5g/kg glass-ceramic powder and arabic gum），negative control group（arabic gum in equal volume），and positive control group（oral administration of 40mg/kg cyclophosphamide）.The mice orally intook the equivalent liquor and were sacrificed with bone marrow cells abstracted 24hours later.The micronucleated cells were counted in 1000polychromatic erythrocytes （PCE）per mouse，then the rate of the micronucleus in every group was measured.ResultsThe rate of the micronucleus in glass-ceramic group，negative control group and positive control group was 1.31±0.53‰，1.32±0.62‰ and 29.20±0.74‰ respectively.There was no significant difference in the rate of the micronucleus between the experimental and negative groups （P>0.05），while a significant difference in the rate of the micronucleus was observed between experimental and positive groups（P<0.01）.ConclusionThe new machinable bioactive glass-ceramic materials couldn’t increase the micronucleus rate of mouse bone marrow cells.

glass-ceramic；micronucleus test；mutagenicity

R783.1

A

0258-4646（2010）01-0028-03

遼寧省教育廳高校科研基金資助項目（05L481）

郝玉全（1975-），男，主治醫師，博士研究生.

艾紅軍，E-mail：aih0620@yahoo.com.cn

2009-09-21