5-FU和放射線聯合應用對人子宮頸腺癌HeLa細胞凋亡的影響

楊濱，蔡敏，閻華，鄒華偉，楊帆，劉淵

（1.中國醫科大學 附屬盛京醫院婦產科，沈陽 110004；2.遼寧省計劃生育科學研究院 附屬醫院，沈陽 110031）

5-FU和放射線聯合應用對人子宮頸腺癌HeLa細胞凋亡的影響

楊濱1，蔡敏1，閻華2，鄒華偉1，楊帆1，劉淵1

（1.中國醫科大學 附屬盛京醫院婦產科，沈陽 110004；2.遼寧省計劃生育科學研究院 附屬醫院，沈陽 110031）

目的 研究5-氟尿嘧啶（5-FU）和放射線聯合應用對人子宮頸腺癌HeLa細胞凋亡的影響。方法 將人子宮頸腺癌HeLa細胞分為單純5-FU化療組、單純放射線組、放化療聯合組（5-FU和放射線聯合應用組）及空白對照組4組。應用MTT法篩選5-FU作用于人子宮頸腺癌HeLa細胞的藥物濃度（48h IC50）；經AnnexinⅤ-FITC/PI雙標記流式細胞技術（FCM）進行細胞凋亡分析；用熒光顯微鏡觀察各組細胞經作用后凋亡的形態學變化。結果 單純化療、單純放療及放化療聯合都可誘導HeLa細胞凋亡，放化療聯合組與單純化療和單純放療組比較可明顯增加HeLa細胞凋亡率（P<0.05）。結論 5-FU和放射線聯合應用可明顯增加人子宮頸腺癌HeLa細胞的凋亡，為臨床應用提供理論依據。

5-氟尿嘧啶；放射線；HeLa細胞；凋亡

子宮頸癌是婦科常見的惡性腫瘤之一，雖然其總體發病率及死亡率呈下降趨勢，但子宮頸腺癌的發病率近年來明顯增加，世界范圍內的檢出率已達10%～22%［1］。宮頸癌傳統治療主要以手術和放療為主［2］，可使部分患者得到根治或緩解，但子宮頸腺癌單純手術或放療后仍易短期內復發或轉移，且對化療又不敏感，故預后不良。近年來有報道［3～5］新輔助化療（即術前或放療前的化療）和同步放化療等一些新的治療手段，可減少病灶的體積，消除亞臨床轉移，提高手術或放療的效果，化療與放療的聯合已成為腫瘤治療方面的研究重點。5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）作為一種抗代謝類抗腫瘤藥物，已被廣泛應用于多種惡性腫瘤的治療，也是子宮頸癌新輔助化療的常用藥物之一，并且還有一定的放射增敏效果［6］。另外，5-FU還是新型口服型氟尿前體類藥物卡培他濱（capecitabine，CAP）在體內選擇性發揮抗腫瘤作用的活性成份［7］。因此本文通過檢測細胞凋亡探討了5-FU和放射線（radiotherapy，RT）聯合在人子宮頸腺癌HeLa細胞株中的應用效果，以期為應用卡培他濱與放療聯合治療子宮頸腺癌提供依據。

1 材料與方法

1.1 細胞株和試劑

人子宮頸腺癌HeLa細胞株由盛京醫院中心實驗室提供；RPMI1640培養基為?？寺∩镏破酚邢薰井a品；胎牛血清為天津市灝洋生物制品科技責任有限公司產品；四甲基偶氮唑藍（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）為北京夏斯生物技術有限公司產品；異硫氰酸熒光素（FITC）標記的Ca2+依賴性磷脂結合蛋白Ⅴ（AnnexinⅤ）和碘化丙錠為北京博奧森生物技術有限公司產品；5-FU為上海旭東海普藥業公司產品。

1.2 主要設備和儀器

垂直單向流潔凈工作臺（青島海爾特種電冰柜有限公司，型號 HRLD-ZD）；解剖顯微鏡（Olympus）；倒置顯微鏡（Olympus）；CO2培養箱（GASINCUBATORTE-HERWATEER-JACKETHIRASAWA）；冰箱（Haier）；低溫離心機；高壓滅菌器（LDZX-40BⅠ型上海申安醫療器械廠）；電熱恒溫鼓風干燥箱（101-3-BS-Ⅱ型上海躍進醫療器械廠）；自動酶標讀數儀（Tanon Gis-1000Labsystems Dragon Wellscan MK3）；流式細胞儀（FACSCalibur美國BD公司）；熒光顯微鏡（Olympus）；X線瓦里安直線加速器2300C/DSN（293美國CLINA）。

1.3 方法

1.3.1 HeLa細胞的培養：HeLa細胞株單層貼壁培養于含 10%胎牛血清、100U/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素的RPMI1640培養液中，37℃、飽和濕度、5%CO2的培養箱中培養。每周傳代2次，實驗時用對數生長期細胞。

1.3.2 MTT法檢測5-FU處理HeLa細胞48h的50%抑制濃度（inhibitory concentration 50，IC50）：收集對數生長期細胞，調整細胞懸液濃度，分于96孔板，每孔 200μl，5000～10000個細胞/孔。置 37℃、5%CO2培養箱培養24h使細胞貼壁。更換新鮮培養液后加入5-FU處理細胞，終濃度分別為250，125，62.5，31.3，15.6，7.8，3.9，2.0，1.0和 0.5μg/ml，每個劑量設6個重復孔，同時設空白對照組（未加藥物），繼續培養 48h。每孔加入 20μl MTT溶液（5mg/ml），繼續培養4h。然后吸掉上清，每孔加入150μl二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10min，使結晶物充分溶解。在酶聯免疫檢測儀490nm處測量各孔的吸光度值。增殖抑制率（%）＝（對照組OD值-加藥組OD值）/對照組OD值×100，作出增殖抑制率曲線，以此找到5-FU處理HeLa細胞48h的IC50。

1.3.3 流式細胞術檢測HeLa細胞凋亡：取對數生長期HeLa細胞，按1×106/ml將單細胞懸液2ml接種至6孔細胞培養板中，培養24h。將細胞隨機分為空白對照組、單純5-FU組、單純放射線組及5-FU+放射線聯合組4組。更換新鮮培養液，空白對照組不進行任何處理；單純5-FU組分別加入根據MTT法所選出的大于及等于IC50的2種濃度的5-FU。單純放射組放射線的照射取2Gy、6Gy 2個劑量；5-FU+放射線聯合組先進行放射線的照射，后根據分組情況分別加入大于或等于IC50濃度的5-FU。每組均設3個重復孔，繼續培養24，48h后，離心收獲細胞。以磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌后，采用異硫氰酸熒光素（FITC）標記的annexinⅤ和碘化丙錠染色，置于流式細胞儀上進行細胞凋亡檢測。

1.3.4 熒光顯微鏡觀察凋亡細胞形態：取對數生長期子宮頸腺癌HeLa細胞，制成濃度為2.5×105/ml的細胞懸液，將細胞懸液按2ml/孔加至放有蓋玻片的6孔板內，使每孔內細胞數為5×105個。將細胞于蓋玻片上生長24h后更換新鮮培養液，與前述方法相同分組，每組均設3個重復孔，各組應用與前述同等濃度及劑量的5-FU、放射線及5-FU+放射線聯合誘導細胞凋亡。繼續培養24及48h后，用PBS洗滌2次。在 500μl的 Binding buffer中加入 10μl annexinⅤ-FITC、5μl Propidium Iodide混勻。將上述溶液滴加于蓋玻片表面，使長有細胞的蓋玻片表面均勻覆蓋。避光、室溫反應5min。將蓋玻片倒置于載玻片上，于熒光顯微鏡下觀察。annexinⅤ-FITC熒光信號呈綠色，碘化丙錠熒光信號呈紅色。1.4 統計學分析

數據使用SPSS13.0進行處理，組內比較采用配對t檢驗，組間比較采用單因素方差分析。P<0.05表示有統計學意義。

2 結果

2.1 MTT法檢測5-FU48h IC50

不同濃度5-FU處理HeLa細胞48h的增殖抑制率曲線見圖1，可見細胞增殖抑制率隨藥物濃度增加而增加。當濃度為250μg/ml和125μg/ml時，細胞抑制率≥50%，與空白組比較P<0.05，即5-FU處理HeLa細胞48h的 IC50為125μg/ml。故確定125μg/ml和 250μg/ml作為單純化療組的投藥濃度。

2.2 流式細胞術檢測HeLa細胞凋亡的變化

表1顯示各組HeLa細胞凋亡率隨時間變化的情況。可見作用24h時，放化療聯合組均比其相應劑量的單純放療或單純化療組凋亡細胞率高（P<0.01）；125μg/ml 5-FU+6Gy 放射的聯合組所誘導的凋亡細胞最多；聯合組中125μg/ml濃度的5-FU與2Gy或6Gy放射聯合投予，均比濃度為250μg/ml 5-FU與2Gy或6Gy放射聯合投予時所誘導的凋亡細胞多（P<0.05）。作用48h時，放化療聯合組凋亡細胞率均低于其相應劑量的單純化療組但高于其相應劑量的單純放療組（P<0.01）。

表15-FU、放射線、5-FU＋放射線聯合組誘導He La細胞凋亡百分率（±s，%）Fi g.1Th e a p o p t o t i c r a t e o f He La c e l l s i n d u c e d b y 5-FU，RTa n d RTc o mb i n e d w i t h 5-FU（±s，%）The apoptosis of HeLa cells 24h 48h Control 6.38±0.70 6.97±0.155-FU 125μg/ml 11.56±0.291） 0.41±0.221）250μg/ml 12.52±0.451） 35.56±0.361）RT 2Gy 14.09±0.631） 21.51±0.581）6Gy 59.24±0.941） 7.69±0.081）5-FU＋RT 125μg/ml+2Gy 19.93±2.871），2），3） 28.92±0.211），2）250μg/ml+2Gy 18.27±2.771），2） 25.39±0.311），2）125μg/ml+6Gy 66.95±4.561），2），3） 24.57±0.141），2）250μg/ml+6Gy 64.83±3.361），2） 22.57±0.301），2）Group 1）compared with control groupP<0.05；2）compared with corresponding dose of 5-FUor RTgroup at the same timeP<0.01；3）compared with same radiological dose of 5-FUor RTgroup at the same timeP<0.05

2.3 熒光顯微鏡觀察凋亡細胞形態

凋亡細胞對碘化丙錠染料有抗染性，壞死細胞則不能。因此，在細胞凋亡的早期細胞呈現綠色熒光信號（圖2B、2C），而死亡細胞可被碘化丙錠著染產生紅色熒光（圖2D），正?；罴毎臒晒夂苋鮾H能看到輪廓（圖2A）。圖2B、2C、2D中均可見到典型的細胞凋亡改變，細胞核縮小，染色質凝集，細胞表面形成突起，部分突起與細胞脫離，形成凋亡小體。

3 討論

多基因突變的細胞失控性生長、細胞增殖失控和凋亡受阻是惡性腫瘤發生、發展的主要原因［8］。有效誘導腫瘤細胞凋亡是腫瘤治療的新方法之一，放射可誘導腫瘤細胞發生凋亡，并加速細胞凋亡過程而使更多的腫瘤細胞死亡，從而使腫瘤發生消退［9］。放療和化療均可誘發細胞凋亡［10］。從本研究結果中可以看出單純5-FU，單純放療及5-FU和放療聯合都可誘導人子宮頸腺癌HeLa細胞凋亡，但聯合治療的效果明顯高于單純放療或者單純5-FU，說明兩者聯合后有協同作用產生，能誘導更多的HeLa 細胞發生凋亡，這與文獻報道［6，11］在其他腫瘤細胞中的作用一致。其單純化療組隨藥物濃度增加凋亡細胞產生增多且有一定的時間依賴性；單純放療組放療后24h，隨著劑量增加產生的凋亡細胞逐漸增多，但放療后48h，隨著劑量的增加凋亡細胞的產生反而出現減少，這可能與繼發性壞死細胞和細胞碎片增多有關。放化療聯合組中，兩種不同濃度5-FU與放射劑量6Gy的聯合效果均明顯好于和放射劑量2Gy聯合的效果；其中5-FU濃度為125μg/ml與放射劑量6Gy的聯合效果比5-FU濃度為250μg/ml與6Gy放療的聯合效果還好，誘導產生的早期凋亡細胞最多。由此可以看出并不是隨著藥物濃度、放射劑量及作用時間的增加就能誘導產生更多的凋亡細胞，這可能與細胞在凋亡過程中轉化成了死亡細胞或者是大劑量直接導致了細胞死亡有關。提示聯合應用的5-FU劑量過大可能直接導致HeLa細胞死亡，對正常細胞也可有嚴重損傷，在臨床應用過程中5-FU和放療聯合的效果可能會受5-FU劑量的限制。因此選擇合適劑量的5-FU來與放療聯合既要獲得良好治療效果又要避免產生較大的副作用非常重要。尋找適當的放射劑量和5-FU藥物濃度進行放化療聯合是進一步臨床治療的研究課題。

5-FU結構與尿嘧啶和胸腺嘧啶相似，它通過干擾腫瘤細胞DNA的合成發揮細胞毒性作用，抗癌譜廣，可用于治療各種腫瘤，已廣泛應用于臨床，放療是治療子宮頸癌的重要手段之一，近年來，國內外報道認為放射與細胞凋亡存在密切關系，細胞凋亡是放射治療引起細胞死亡的主要類型之一［4］。細胞凋亡也稱程序性細胞死亡（programmed cell death），是細胞正常死亡的一種途徑。細胞凋亡后在形態學可以觀察到細胞固縮，胞質濃縮，空泡狀，核致密深染呈多葉狀或新月狀，顆粒常聚集在核周邊，破裂的染色質形成圓形或橢圓形大小不等的細胞凋亡小體（apoptotic bodies），位于細胞質內或逐漸向細胞外散落。在本研究中，熒光顯微鏡下觀察到較典型的HeLa細胞凋亡改變。

CAP是一種新型的5-FU前體藥物，并且是目前口服制劑中唯一療效能超過靜脈給藥的氟尿嘧啶類藥物。CAP口服后經小腸吸收入肝臟后，經過三步特殊的代謝過程，最后在腫瘤細胞內通過胸苷磷酸化酶（thymidine phosphorylse，TP）轉化成 5-FU發揮抗腫瘤活性，本身無毒性，對腫瘤細胞選擇性高，特異性強，周身副作用?。?］。本研究前期實驗［13］通過建立裸鼠模型證明CAP對子宮頸腺癌有抑制作用，其與放療聯合顯示出了比單純CAP化療和單純放療都好的抑制效果。另報道［14］X線放射能提高子宮頸腺癌HeLa細胞TP酶的表達，二氫嘧啶脫氫酶（dihydropyrimidine dehydrogenase，DPD，5-FU代 謝失活的限速酶）表達不受影響，TP/DPD比值升高，因而能提高CAP對子宮頸腺癌HeLa細胞的抗腫瘤活性。本研究結果也顯示5-FU和放射聯合能誘導更多的HeLa細胞發生凋亡。因此提示臨床放射治療子宮頸腺癌時，同時投給CAP，可能獲得比5-FU和放療聯合更佳的治療效果，而且更能減少5-FU的毒副作用，是一種值得期待的子宮頸腺癌聯合治療方法。

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（編輯 武玉欣，英文編輯 鄭華川）

Effect of 5-Fluorouracil and Radiotherapy on the Apoptosis of Human Cervical Adenocarcinoma HeLa Cells

YANGBin1，CAIMin1，YANHua2，ZHOUHua-wei1，YANGFan1，LIUYuan1
（1.Department of Obstetrics and Gynecology，Shengjing Hospital，China Medicial University，Shenyang 110004，China；2.Department of Gynecology，Family Planning Research Institute，Affiliated Hospital of Liaoning Province，Shenyang 110031，China）

ObjectiveTo investigate the effect of 5-fluorouracil（5-FU）combined with radiotherapy（RT）on the apoptosis of human cervical cancer HeLa cells.MethodsThe HeLa cells were divided into four groups treated with chemotherapy（ChT），RT，RT+ChT，and control groups.The non-cytotoxic concentration （48h IC50） of HeLa cells treated with 5-FUwas determined by methyl thiazolyl tetrazolium（MTT）and the apoptosis rates of HeLa cells detected by flow cytometry with annexinⅤ-FITCand PIdouble labeling.The morphologic changes of the apoptosis cells were observed under fluorescence microsope.ResultsChT，RTand RT+ChTtreatment could induce the apoptosis of HeLa cells with the strong induction of the combined treatment （P<0.05）.Conclusion5-FUcombined with RTcan obviously enhance the apoptosis of HeLa cells，which provides a reliable experimental evidence for clinical use of 5-FUcombined with RTin the intervention of human cervical cancer.

5-fluorouracil；radiotherapy；HeLa cells；apoptosis

R711.74

A

0258-4646（2010）01-0024-04

楊濱（1960-），女，教授，博士.E-mail：yangbinfdy@126.com

2009-10-03