胃黏膜特異表達JC病毒T抗原質粒構建及表達鑒定

夏蒲，徐小燕，賈寶萍，王薇，關一夫，高野康雄，鄭華川

（1.中國醫科大學 基礎醫學院生物化學研究室，沈陽 110001；2.中國醫科大學 基礎醫學院病理生理學教研室；3.中國醫科大學 檔案館，沈陽 110001；4.日本富山大學 醫學部病理診斷教室，日本 富山 930-0194）

胃黏膜特異表達JC病毒T抗原質粒構建及表達鑒定

夏蒲1，徐小燕2，賈寶萍3，王薇2，關一夫1，高野康雄4，鄭華川1

（1.中國醫科大學 基礎醫學院生物化學研究室，沈陽 110001；2.中國醫科大學 基礎醫學院病理生理學教研室；3.中國醫科大學 檔案館，沈陽 110001；4.日本富山大學 醫學部病理診斷教室，日本 富山 930-0194）

目的 利用鼠胃黏膜上皮細胞中高活性的角蛋白19（K19）啟動子構建K19-JCVT抗原表達質粒并進行鑒定。方法 利用PCR方法突變JC病毒T抗原中的NdeⅠ位點，并在兩端插入BclⅠ位點，通過BamHⅠ位點將DNA片段與K19啟動子連接，構建K19-JCVT抗原質粒。利用酶切和DNA測序確認其DNA序列。免疫組化篩選細胞角蛋白19陽性胃癌細胞，對細胞角蛋白19表達陽性的胃癌細胞系AGS進行K19-JCVT抗原質粒轉染，用Western blot方法檢測JCVT抗原的表達情況。結果K19-JCVT抗原表達質粒成功構建，AGS胃癌細胞系高表達細胞角蛋白19并用于K19-JCVT抗原表達質粒轉染，轉染K19-T抗原質粒的AGS細胞系有T抗原表達。結論 同義突變和相似連接在質粒構建中起到關鍵作用，酶切位點的甲基化也是值得注意的問題。

JC病毒；T抗原；真核表達；載體構建

JC病毒（John Cunningham virus，JCV）是多瘤病毒家族成員之一，人體和動物實驗證明其與惡性腫瘤發生關系密切［1～4］。本研究小組成員利用巢式PCR和Southern雜交方法檢測JCV，結果發現胃癌中存在JCVT抗原基因，實時PCR檢測結果表明胃癌中JCV拷貝數顯著高于正常胃黏膜，原位PCR證實JCVT抗原存在于胃癌細胞核中，提示JCVT抗原可能參與胃黏膜上皮細胞惡變［5］。日本學者利用胃黏膜上皮細胞中高活性的角蛋白19（keratin 19，K19）啟動子成功建立了胃癌轉基因動物模型，為胃癌研究人員提供了方便快捷的胃腫瘤動物模型［6］。本研究通過構建能夠在含K19啟動子的胃黏膜中特異表達的JCV抗原表達質粒，為轉基因小鼠及胃癌動物模型的建立提供穩定、可靠的分子工具。

1 材料與方法

1.1 構建pBSK-T抗原質粒

設計引物 P1和 P4、P2和 P3，以 pBSK-JCVmad1質粒為模板選用具有高保真性能的pfu DNA polymerase進行PCR擴增。通過同義突變，將NdeⅠ的酶切位點CCATATGCA突變成SplⅠ酶切位點CCGTACGCA。其中脯氨酸CCA同義突變成脯氨酸CCG，酪氨酸TAT同義突變成酪氨酸TAC。反應條件為：94℃預變性 3min；94℃ 45s，65℃ 45s，72℃ 60s，共30個循環。將所得PCR產物用BKL試劑盒進行磷酸化，通過HincⅡ位點酶切并去磷酸化后與pBSK質粒連接，構建的質粒命名為pBSK-P1-P4和pBSK-P2-P3。然后將pBSK-P1-P4和pBSK-P2-P3分別用XhoⅠ和SplⅠ進行雙酶切。將酶切產物進行連接，構建pBSK-T抗原質粒。用HincⅡ/HindⅢ對連接的質粒進行鑒定（圖1）。

1.2 構建K19-JCVT抗原表達質粒

將pBSK-T抗原質粒先用scs110進行轉化，然后擴增及純化，再用BclⅠ酶切，瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收。將Cox2片段用BamHⅠ從K19-Cox2質粒切下來，瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收余下的K19載體。由于BclⅠ和BamHⅠ有相同的黏末端，所以酶切后可進行連接，構建質粒K19-T抗原。NdeⅠ和BamHⅠ酶切鑒定重組體，測序鑒定T抗原基因插入的方向及DNA序列，插入方向正確的重組體記為K19-T抗原質粒，設計引物進行測序鑒定。

1.3 細胞培養

在37℃、5%CO2和含10%胎牛血清培養液的條件下培養胃癌細胞系，MKN28（高分化腺癌）、MKN45（低分化腺癌）和KATO-Ⅲ（印戒細胞癌）在RPMI1640培養液里進行培養，HGC-27（未分化腺癌）在MEM培養液中進行培養，而AGS（中分化腺癌）在Ham F12培養液中進行培養。

1.4 免疫組化

所有細胞離心收集并用PBS緩沖液洗后固定在10%的福爾馬林中，常規方法制作成石蠟標本，并切成4μm切片。石蠟切片脫蠟至水化并用TRS（DAKO，Carpinteria CA93013，USA）進行抗原修復，5%胎牛血清封閉5min阻斷非特異性結合，抗人-細胞角蛋白 19一抗（Neomarker；1∶100）孵育 15min，抗鼠IgG-HRP二抗孵育（DAKO，即用型）15min，最后進行DAB顯色、蘇木精復染和封片，孵育和DAB顯色在間歇微波照射中進行，孵育后用TBST洗去非特異性結合，去除一抗作為陰性對照。

1.5 細胞轉染和Western印跡雜交

篩選細胞角蛋白19（cytokeratin 19）表達陽性的細胞進行K19-T抗原轉染。依據Effectene（QIAGEN）產品說明，將K19-JCVT抗原表達質粒轉染到AGS胃癌細胞系中，pEGFP-N1作為陽性對照檢測轉染體系。利用RIPA裂解液［50mmol/LTris-HCl（pH7.5），150mmol/LNaCl，5mmol/LEDTA，0.5%Nonidet P-40，5mmol/Ldithiothreitol，10mmol/LNaF，protease inhibitor cocktail（Sigma）］和超聲粉碎提取細胞總蛋白。利用BCA試劑盒（Pierce）蛋白定量后取100μg蛋白樣品經10%的SDS-PAGE電泳后，將蛋白轉移到Hybond膜（Amersham）上，用5%脫脂奶粉/0.1%Tween20/TBS（TTBS）室溫封閉膜 1h，一抗用兔SV40T抗原（抗SV40T抗原抗體與JCVT抗原可交叉反應；Santa Cruz；1∶500） 孵育 1h，TTBS洗3次，加入辣根酶標記的羊抗兔-IgG（DAKO；1∶1000）于室溫孵育 1h，ECL顯色（Santa Cruz），富士LAS2000檢測陽性信號。

2 結果

2.1 pBSK-T抗原質粒構建與鑒定

JCVT抗原PCR產物瓊脂糖凝膠電泳結果，磷酸化后插入pBSK的多克隆位點。通過XhoⅠ和SplⅠ進行雙酶切將分割JCVT抗原連接，突變NdeⅠ為SplⅠ，兩端加入BclⅠ位點。用HincII/HindIII雙酶切pBSK-JCVT抗原質粒，所得3條DNA片段符合預期片段（圖2），測序鑒定了插入基因的正確性。

2.2 K19-T抗原質粒構建與鑒定

將構建的pBSK-JCVT抗原質粒轉入SCS110感受態細胞后，提取DNA并進行BclⅠ酶切，與K19-COX-2質粒BamHⅠ酶切片斷連接，利用NdeⅠ和BamHⅠ酶切鑒定。構建的K19-T抗原質粒用NdeⅠ酶切電泳，可見到2條DNA條帶，用BamHⅠ酶切電泳，可見到1條DNA條帶，利用兩酶聯合切割，可得到3條帶，與預期結果一致（圖3）。設計引物后，進行測序。結果發現突變位點和JCVT抗原兩端序列完全正確（圖4）。

2.3 細胞角蛋白19蛋白表達篩選及K19-JCVT抗原表達質粒轉染表達

細胞角蛋白 19在 AGS、MKN28、MKN45、KATOⅢ、HGC-27細胞系中都是陽性表達（圖5）。細胞角蛋白19的啟動子是K19，所以細胞角蛋白19陽性表達的細胞可以激活K19啟動子。以pEGFP-N1為內參將K19-T抗原表達質粒轉染至AGS細胞系。Western blot結果顯示，實驗組中存在大T抗原（分子量為94kDa）的表達，而對照組中未出現（圖5）。

3 討論

JC病毒（還包括SV40和BK病毒）基因組為環狀閉合雙鏈DNA（約5.2kb），含有T抗原、VP和agnoprotein3個主要基因。T抗原為早期編碼基因，通過選擇性剪接可形成大T和小t抗原。大T抗原具有ATP酶、解旋酶和聚合酶活性，在病毒基因組復制中發揮重要作用。agnoprotein為一個小調節蛋白編碼基因［1，2］。

JCV中起關鍵致癌作用的大T抗原可與抑癌基因pRb和p53編碼蛋白結合而使其喪失對細胞周期和凋亡的調節，抑制Wnt信號傳導途徑進而促進β-鏈接素核移動和癌基因c-myc蛋白表達，可上調胰島素受體底物1（insulin receptor substrate 1，IRS-1）和胰島素樣生長因子1型受體（insulin-like growth factor-1receptors，IGF-1R）表達及磷酸化來促進細胞增殖，通過與AP-1轉錄因子結合而擾亂正常細胞生命活動［3～5］。總之，T抗原在JCV致癌的生物學過程中發揮重要作用。

由于K19-Cox-2質粒啟動子兩側有NdeⅠ酶切位點，所以設計PCR引物的時候，將T抗原中的脯氨酸CCA同義突變成脯氨酸CCG，酪氨酸TAT同義突變成酪氨酸TAC，進而將NdeⅠ酶切位點突變成BclⅠ。然后可以在構建好的pBSK-T抗原質粒中利用BclⅠ酶切下T抗原后插入K19質粒中。

SCS110是endA-衍生的JM110菌株。SCS110為質粒或噬菌體DNA的制備提供理想場所，使質粒或噬菌體DNA免于Dam或者Dcm甲基化，因此1個或多個甲基化敏感的限制性內切酶可以切割DNA［7］。實驗中使用的BclⅠ是甲基化敏感的限制性內切酶，構建的pBSK-T抗原質粒在用SCS110轉化后，可以被BclⅠ酶切下來，進而可以繼續下一步連接反應。在本實驗中曾經用DH5α對質粒進行轉化，但是擴增的質粒無法用BclⅠ進行切割及連接。

本實驗選用的Stratagene的Pfu酶是一種熱穩定性DNA聚合酶，從攜帶Pyrococcus furiosus的pol基因的大腸桿菌中分離得到［8，9］。該酶具有 3′到 5′校讀外切酶活性，催化DNA合成，并且錯誤率極低。Pfu是目前已發現的所有聚合酶里面保真度最高的聚合酶。我們在實驗中曾經使用其他的DNA聚合酶，都沒有達到預期的效果。

建立在胃組織特異細胞中表達的JCVT抗原基因真核表達載體，將為轉基因小鼠及胃癌動物模型的建立提供穩定、可靠的分子工具。胃癌是消化道惡性腫瘤中最多見的癌種，死亡率居惡性腫瘤之首位，建立胃癌腫瘤動物模型可為胃癌的早期診斷、治療和發病機制的研究提供非常有用的實驗動物模型。

［1］Zheng HC，Yan L，Cui L，et al.Mapping the history and current situation of research on John Cunningham virus-a bibliometric analysis［J］.BMCInfect Dis，2009，9（1）：28.

［2］Zheng H，Murai Y，Hong M，et al.JCvirus detection in human tissue specimens［J］.JClin Pathol，2007，60（7）：787-793.

［3］Kutsuna T，Zheng H，Abdel-Aziz HO，et al.High JCvirus load in tongue carcinomas may be a risk factor for tongue tumorigenesis［J］.Virchows Arch，2008，452（4）：405-410.

［4］Zheng H，Abdel-Aziz HO，Nakanishi Y，et al.Oncogenic role of JCvirus in lung cancer［J］.JPathol，2007，212（3）：306-315.

［5］Murai Y，Zheng HC，Abdel-Aziz HO，et al.High JCvirus load in gastric cancer and adjacent non-cancerous mucosa ［J］.Cancer Sci，2007，98（1）：25-31.

［6］Oshima H，Oshima M，Inaba K，et al.Hyperplastic gastric tumors induced by activated macrophages in COX-2/mPGES-1transgenic mice［J］.EMBOJ，2004，23（7）：1669-1678.

［7］Kawachi R，Koike Y，Watanabe Y，et al.Development of a genetic system in chitinase-producing streptomyces and the application of an allosamidin-insensitive chitinase gene to homologous overexpression［J］.Mol Biotechnol，2004，26（3）：179-186.

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（編輯 武玉欣，英文編輯 鄭華川）

The Construction and Expression Confirmation of JCVirus TAntigen Expression Plasmid in Gastric Mucosa

XIAPu1，XUXiao-yan2，JIABao-ping3，WANGWei2，GUANYi-fu1，TAKANOYasuo4，ZHENGHua-chuan1
（1.Department of Biochemistry and Molecular Biology；2.Department of Pathopysiology，College of Basic Medical Sciences，China Medical University，Shenyang 110001，China；3.The Archives，China Medical University，Shenyang 110001，China；4.Department of Diagnostic Pathology，School of Medicine，U－niversity of Toyama，Sugitani 930-0194，Japan）

ObjectiveTo construct and confirm the JCvirus（JCV）Tantigen expression plasmid using mouse keratin 19（K19）promoter specific for the gastric epithelial cells.MethodsThe NdeIsite was mutated by PCRwith BclIinsertion at both sides.The DNAfragment digested by BclⅠ was ligated with the plasmid containing K19promoter via BamⅠ site.The DNAsequence was confirmed by restriction enzyme digestion and direct DNAsequencing.Cytokeratin 19protein was examined to screen gastric carcinoma cell for transfection of K19-JCVTantigen expression plasmid by immunohistochemistry.The Western blot was employed to detect the JCVTantigen expression in the gastric carcinoma transfectant.ResultsK19-JCVTantigen expressing plasmid was successfully constructed.The AGSstrongly expressed cytokeratin 19protein and was selected for the transfection of K19-JCVTantigen expressing plasmid.JCVTantigen was positively expressed in the AGStransfectant.ConclusionThe synonymous mutation and compatible ligation are useful in the plasmid construction.The methylation of restriction enzyme should be considered.It is meaning for the transgenic animal model of gastric carcinoma to successfully construct the JCvirus Tantigen expression plasmid in gastric mucosa.

JCvirus；Tantigen；eukaryotic expression；vector construction

R731

A

0258-4646（2010）01-0018-04

沈陽人才資源開發基金項目；遼寧省百千萬人才工程資助項目；教育部歸國人員科研啟動基金項目；人事部留學人員科技活動擇優資助項目；2009年沈陽市科學技術計劃資助項目（1091175-1-00）

夏蒲（1982-）男，碩士研究生.

鄭華川，E-mail：zheng_huachuan@hotmail.com

2009-05-22