大鼠神經干細胞中MAPKK/MEK-MAPK/ERK信號轉導通路的實驗研究

趙宇，謝鵬，朱曉峰，蔡志友

（1.重慶醫科大學 附屬第一醫院神經內科，重慶 400016；2.佳木斯大學 神經科學研究所，黑龍江 佳木斯 154007）

大鼠神經干細胞中MAPKK/MEK-MAPK/ERK信號轉導通路的實驗研究

趙宇1，謝鵬1，朱曉峰2，蔡志友1

（1.重慶醫科大學 附屬第一醫院神經內科，重慶 400016；2.佳木斯大學 神經科學研究所，黑龍江 佳木斯 154007）

目的 應用絲裂原激活的蛋白激酶激酶（MAPKK/MEK）特異性阻滯劑PD98059孵育大鼠神經干細胞（NSC），探討MAPKK/MEK-MAPK/ERK信號通路在NSC中的作用。方法 體外分離、培養大鼠NSC，應用不同濃度的PD98059孵育NSC后進行WTS-8、Nestin，BrdU、β-tubulin-Ⅲ、Western blot檢測。結果 PD98059對NSC的存活、增殖和分化的影響呈劑量依賴性，在PD98059較高濃度時NSC的存活率明顯下降（P<0.05），BrdU和β-tubulin-Ⅲ的陽性細胞數明顯少于正常對照組（P<0.05）。PD98059阻斷ERK表達的作用呈劑量依賴性。結論 MAPKK/MEK-MAPK/ERK信號通路對大鼠NSC的存活、增殖、分化起重要作用。

絲裂原激活的蛋白激酶激酶；細胞外信號調控激酶；神經干細胞

目前已知絲裂原激活的蛋白激酶（mitogen activated protein kinases，MAPK）在所有真核細胞中均有表達，MAPK屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，可被細胞因子、神經遞質、激素等多種刺激因素所激活，是將細胞外信號轉導至細胞內部的主要途徑，MAPK激活后可磷酸化核轉錄因子和其他蛋白激酶等多種底物，調節相關基因轉錄，進而參與細胞生長、發育等多種生理過程［1～6］。神經干細胞（neural stem cells，NSC）是一種具有自我更新、多分化潛能的原始細胞，是神經發生的啟動者，目前對于多種神經系統疾病的治療方向是促進神經發生，NSC的獨特優點使它成為治療神經系統疾病的焦點［7，8］，本實驗通過應用絲裂原激活的蛋白激酶激酶（mitogen activated protein kinases kinases，MAPKK/MEK）的特異性阻滯劑PD98059孵育大鼠NSC，探討該通路在NSC中的作用，為確定NSC增殖、分化的調控靶點提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

TC2323型CO2培養箱（美國Sheldon公司）、CX-RFL-2落射熒光顯微鏡（日本Olympus公司）、LEICADMIL倒置生物顯微鏡（德國LEICA公司）、ELX-800全自動酶標儀（美國BIO-TEK公司）、SDSPAGE蛋白電泳儀和蛋白轉膜儀（上海天能公司）。培養NSC所用動物為準確胎齡的Wistar孕鼠，購于重慶醫科大學實驗動物中心。DMEM/F-12、B27、HBSS液、胎牛血清購于美國Gibco公司；EGF、bFGF購于美國Sigma公司；LY294002購于美國Promega公司；Cell Counting Kit-8試劑盒購于日本同仁公司；多聚賴氨酸、兔抗大鼠Nestin、小鼠抗大鼠BrdU、兔抗大鼠β-tubulin-Ⅲ、FITC標記的山羊抗小鼠IgG、TRITC標記的山羊抗兔IgG等均購于美國Santa Cruz公司。BCAProtein Kit（HyClone-Pierce公司）；Prestained protein marker（中晶公司）；ECL-PLUS/Kit（Amersham 公司）；兔抗P44/42MAPK（ERK1/2）多克隆抗體、小鼠 Phospho-P44/42MAPK（ERK1/2）（Thr202/Tyr204）多克隆抗體、羊抗小鼠IgG-HRP和羊抗兔IgG-HRP（Cell Signaling Technology公司）。

1.2 方法

1.2.1 NSC的分離、培養：無菌條件下取E15-16大鼠胎鼠全腦，保留嗅腦，去除小腦，用組織分離液（DHank）沖洗干凈。仔細剝離血管和腦膜，剪碎，加0.25%胰酶37℃消化10～20min，500g離心5min，去除上清液，加入NSC培養基（DMEM/F12+2%B27+20ng/ml bFGF+20ng/ml EGF），吹打成為單細胞懸液，按照2×106/ml的比例接種于塑料培養瓶，置于 37℃、5%CO2、80%濕度（HR）條件下 CO2培養箱中懸浮培養。隔2～3d換半量培養液1次。

1.2.2 NSC的Nestin鑒定：取原代培養和傳代培養的神經球滴在涂布0.1%多聚賴氨酸的無菌蓋玻片上，37℃、5%CO2、80%濕度（HR）培養箱孵育2d后，取出蓋玻片用0.01mol/LPBS（pH7.2）洗滌，行Nestin細胞免疫組化鑒定，兔抗Nestin的濃度為1∶400。

1.2.3 經PD98059孵育后NSCWST-8檢測：用不同濃度的PD98059（0～20mmol/L）孵育NSC12h后用Cell Counting Kit-8試劑盒做WST-8檢測，通過OD值了解PD98059對NSC存活的影響。

1.2.4 經PD98059孵育后NSCBrdU鑒定：將BrdU溶于無血清培養液，BrdU終濃度為5μmol/L，然后用不同濃度的PD98059（0～20mmol/L）孵育NSC5d后，吸出細胞球滴在涂布10%多聚賴氨酸的無菌蓋玻片上，2d后做BrdU免疫組化鑒定，其中小鼠抗BrdU的濃度為1∶400。

1.2.5 經PD98059孵育后 NSCβ-tubulin-Ⅲ鑒定：用不同濃度的PD98059（0～20mmol/L）孵育NSC2d后，吸出細胞球滴在涂布10%多聚賴氨酸的無菌蓋玻片上，加入含10%FBS的DMEM/F12誘導分化，14d后做β-tubulin-Ⅲ免疫組化鑒定，兔抗大鼠βtubulin-Ⅲ的濃度為1∶400。

1.2.6 經PD98059孵育后NSCWestern blot檢測：用不同濃度的PD98059（0～20mmol/L）孵育NSC60min后做Western blot檢測。用0.01mol/LPBS洗滌細胞后，加入適量預冷的含蛋白酶抑制劑（PI）1×Lysis buffer裂解細胞，超聲破碎儀破碎細胞后取上清，采用BCAProtein Assay Kit測蛋白濃度后，每個樣品均調整為 2μg/μl的蛋白終濃度，每孔上樣 20μl后進行SDS-PAGE電泳，電流強度為15mA，電泳2h。電泳結束后，進行轉膜，電轉移的條件設定為恒流400mA，2h。然后將PVDF膜浸泡入5%的脫脂牛奶中，4℃過夜后加入一抗（1∶1000的兔抗P44/42MAPK（ERK1/2）和小鼠 Phospho-P44/42MAPK（ERK1/2）（Thr202/Tyr204）） 室溫下孵育 2h，TBST洗膜后加入二抗（1∶5000的辣根過氧化物酶驢抗兔/小鼠IgG）室溫下孵育2h，TBST和TBS洗膜后進行ECL顯色反應、曝光、顯影、過水、定影。

1.3 統計學處理

計算染色后BrdU、β-tubulin-Ⅲ陽性細胞的數目。每個處理組做3張染片，每張染片隨機計數10個非重疊視野（×200）下的陽性細胞數，數據用±s表示，用SPSS13.0軟件進行方差分析，P<0.05認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 NSC的培養及鑒定

自E15-16大鼠胎鼠大腦所得的細胞呈圓形，大小近似，細胞存活率80%～90%，呈懸浮生長，分裂的細胞逐漸形成細胞團，折光性強，邊界清楚（圖1），經免疫組化染色，NSC標記性蛋白Nestin在原代及傳代培養的神經球均有表達（圖2）。胞質及突起著色，表明分離培養的神經球具有胚胎源性。提示所分離培養的細胞是NSC。

2.2 經PD98059孵育后的NSCWST-8檢測結果

在 PD98059高濃度（12.5mmol/L、15.0mmol/L、17.5mmol/L、20.0mmol/L）時對NSC存活的影響與對照組比較差異有統計學意義（P<0.05），說明MAPKK/MEK-MAPK/ERK信號通路在NSC的存活中起重要作用。見表1。

表1NSC經不同濃度PD98059孵育后的OD值（450n m/630n m）、Br d U和β-t u b u l i n-Ⅲ陽性細胞數比較（±s）Ta b.1Th e c o mp a r i s o n o f ODv a l u e（450n m/630n m），Br d U-p o s i t i v e c e l l s a n d β-t u b u l i n-Ⅲ p o s i t i v ec e l l s o f NSCa f t e r i n c u b a te d w i t h d i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n o f PD98059f o r 12h（±s）Group ODvalue BrdUpositive cells β-tubulin-Ⅲ positive cells Control group（0mmol/L） 1.781±0.027 36.33±5.529 3.33±1.1552.5mmol/Lgroup 1.741±0.057 34.13±5.257 2.97±1.2175.0mmol/Lgroup 1.702±0.086 33.97±3.899 3.00±1.0837.5mmol/Lgroup 1.707±0.047 33.83±4.617 2.83±1.08510.0mmol/Lgroup 1.593±0.166 33.43±5.835 2.80±1.18612.5mmol/Lgroup 1.508±0.1011） 33.77±4.1581） 2.77±1.16515.0mmol/Lgroup 1.393±0.1051） 34.40±4.2481） 2.73±1.31117.5mmol/Lgroup 1.173±0.1521） 33.33±4.1801） 2.70±1.1191）20.0mmol/Lgroup 0.991±0.1192） 32.53±5.8001） 2.63±1.0981）1）P<0.05vs control group；2）P<0.01vs control group

2.3 經PD98059孵育后NSC的BrdU陽性細胞結果

在 PD98059的 12.5mmol/L、15.0mmol/L、17.5mmol/L、20.0mmol/L組中BrdU陽性細胞與正常對照組比較下降，差異有統計學意義（P<0.05）（表1）。

2.4 經PD98059孵育后NSCβ-tubulin-Ⅲ陽性細胞結果

當 PD98059濃度為 17.5mmol/L、20.0mmol/L時，β-tubulin-Ⅲ陽性細胞數少于正常對照組，具有統計學意義（P<0.05）（表1），并且可見突觸短小發育不良的神經元（圖3、圖4）。

2.5 經PD98059孵育后NSC的Western blot檢測結果

從Western blot檢測結果可以看出PD98059對磷酸化的絲裂原激活的蛋白激酶（細胞外信號調控激酶）P44/42MAPK（ERK1/2）的抑制作用呈劑量依賴性的（圖 5），說明PD98059對MAPKK/MEKMAPK/ERK信號通路的阻斷作用呈劑量依賴關系。

3 討論

目前已知，MAPK采用高度保守的三級激酶級聯傳遞信號，按激活順序為絲裂原激活的蛋白激酶激酶激酶（MAPKK）-MAPKK-MAPK，它們構成了一個連續的激活途徑。

MAPK信號級聯通路能將由表面受體介導的細胞外信號傳導到細胞核內部，作為最重要的下游組件的ERK1和ERK2，是唯一能在細胞質和細胞核之間穿梭往返的組件。現己證實在MAPK級聯通路中，在接受細胞外信號刺激后，細胞外信號調控激酶（extracellular signal regulated kinase，ERK）是唯一能在核中聚集的物質，主要調節細胞的生長和分化。PD98059是MAPKK/MEK的特異性阻滯劑，在本實驗中，低濃度的PD98059對NSC的存活、增殖和分化沒有明顯影響，但是經較高濃度的PD98059孵育后，NSC的存活、增殖和分化受到明顯抑制，說明PD98059對MAPKK/MEK-MAPK/ERK信號通路的阻斷作用呈劑量依賴關系，本實驗表明在大鼠NSC中MAPKK/MEK-MAPK/ERK信號通路對其多種生理功能起重要作用，MAPKK/MEK-MAPK/ERK信號通路維持正常是大鼠NSC存活、增殖和分化的必要條件。

目前已知MAPK廣泛分布于整個中樞神經系統中。各種細胞外刺激信號，包括神經遞質、神經營養因子、生長因子等均可通過這一通路影響突觸傳遞、神經元的重塑、形態分化和生存等，從而參與神經系統多種疾病的病理過程。神經營養因子和其他刺激神經的化學物質可以激活ERK信號通路，活化的ERK參與神經細胞的存活、分化及神經元結構和功能的可塑性調節［3，9～11］。目前已知轉錄因子活化劑蛋白 1（activator protein-1，AP-1）如糖原合成激酶 3（glycogen synthesis kinase 3，GSK3）［12］及 Bcl-2，BAD，cAMP反應元件結合蛋白（cAMPresponse element binding protein，CREB）和腦源性神經營養因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）均是 MAPKK/MEK-MAPK/ERK通路的下游靶點，它們在神經元的發育、存活和維持神經元的長期可塑性上發揮重要作用［3，9～12］。

目前許多學者認為一些神經因子或促神經發生的藥物是通過MAPKK/MEK-MAPK/ERK信號通路來影響其下游許多信號分子的表達，如果要探究它們是否是通過MAPKK/MEK-MAPK/ERK信號通路調節相關的信號分子，就需要先用MAPKK/MEK的特異性阻滯劑來孵育細胞然后再用因子或藥物來誘導細胞，所以確定NSC中既能抑制ERK的激活又不會影響細胞存活的MAPKK/MEK的特異性阻滯劑的濃度至關重要，因為如果MAPKK/MEK的特異性阻滯劑的濃度過高就會導致細胞死亡，就不會對后面的因子或藥物產生反應，如果MAPKK/MEK的特異性阻滯劑的濃度過低就不會有效抑制MAPKK/MEK-MAPK/ERK信號通路，就不會探明相關信號分子是否是MAPKK/MEK-MAPK/ERK信號通路的下游信號。從本實驗結果可以得知:在NSC中，MAPKK/MEK的特異性阻滯劑PD98059為10～12.5mmol/L時既能有效抑制ERK的激活，又不會影響細胞存活，該濃度可以作為有效阻滯NSC中MAPKK/MEK-MAPK/ERK信號通路的阻滯劑濃度。

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（編輯 武玉欣，英文編輯 鄭華川）

Effect of MAPKK/MEK-MAPK/ERKSignal Transduction Pathway in Rat Neural Stem Cells

ZHAOYu1，XIEPeng1，ZHUXiao-feng2，CAIZhi-you1
（1.Department of Neurology，The First Affiliated Hospital，Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China；2.The Neuroscience Research Institute of Jiamusi University，Jiamusi 154007，China）

ObjectiveTo incubate the rat neural stem cells with specific inhibitor（PD98059）of MAPKK/MEKto clarify the effect of MAPKK/MEK-MAPK/ERKsignaling pathway in neural stem cells（NSC）.MethodsNSCs derived from E15-16rats were isolated and cultured.After treated with different concentration of PD98059，they were subjected to the detection of cell proliferation，Nestin，BrdUand βtubulin-IIIby WTS-8assay，immunofluorescent staining or Western Blot respectively.ResultsPD98059had an effect on the survival，proliferation and differentiation of NSCat a concentration-dependent manner.The viability of the NSCwas significantly decreased than the control（P<0.05），whereas the numbers of BrdU-positive and β-tubulin-Ⅲ positive cells were notably fewer than the control（P<0.05）after incubated with the higher concentration of PD98059.The ERKexpression was blocked by PD98059at a concentration-dependent manner.ConclusionThe MAPKK/MEK-MAPK/ERKsignaling pathway played a vital role in the survival，proliferation and differentiation of NSC.

mitogen activated protein kinases kinases；extracellular signal regulated kinase；neural stem cell

R742

A

0258-4646（2010）01-0014-04

高等學校博士學科點專項科研基金資助項目（20050631012）

趙宇（1973-），女，副主任醫師，博士.E-mail：wangpang0916@yahoo.com.cn

2009-05-22