基底樣乳腺癌與ERK信號傳導通路關系的研究

李超，高婷，陳廣泉，姚凡，葛丹梅，金鋒

（1.中國醫科大學 附屬第一醫院乳腺外科，沈陽 110001；2.中國醫科大學 附屬第一醫院腫瘤研究所第二研究室，沈陽 110001；3.沈陽市第四人民醫院 普通外科，沈陽 110031；4.中國醫科大學附屬第一醫院腎內科，沈陽 110001）

基底樣乳腺癌與ERK信號傳導通路關系的研究

李超1，高婷2，陳廣泉3，姚凡1，葛丹梅4，金鋒1

（1.中國醫科大學 附屬第一醫院乳腺外科，沈陽 110001；2.中國醫科大學 附屬第一醫院腫瘤研究所第二研究室，沈陽 110001；3.沈陽市第四人民醫院 普通外科，沈陽 110031；4.中國醫科大學附屬第一醫院腎內科，沈陽 110001）

目的 檢測三陰性乳腺癌中CK5/6，EGFR，P-ERK的表達，探討基底細胞樣乳腺癌與ERK/MAPK信號傳導通路的關系。方法 采用免疫組化法檢測CK5/6，EGFR，P-ERK在70例三陰性乳腺癌組織中的表達。結果 在（70例）三陰性乳腺癌中，CK5/6與EGFR的陽性表達率分別為68.6%（48/70），57.1%（40/70），共篩出基底細胞樣乳腺癌53例。在三陰性乳腺癌中P-ERK在基底細胞樣乳腺癌與非基底細胞樣乳腺癌的陽性表達率分別為79.2%（42/53），47.1%（8/17），其差異有統計學意義（P<0.05）。CK5/6與EGFR、P-ERK在基底細胞樣乳腺癌的表達中具有正相關性（r=0.471；0.389，P<0.05）。結論 CK5/6，EGFR是診斷基底細胞樣乳腺癌的重要分子標記物；基底細胞樣乳腺癌的發生發展與ERK/MAPK信號傳導通路被異常激活有關；CK5/6與EGFR、P-ERK在基底細胞樣乳腺癌的表達中具有相關性。

基底細胞樣乳腺癌；免疫組化；CK5/6；EGFR；P-ERK

近年來，基底細胞樣型乳腺癌（basal-like breast carcinoma，BLBC）被廣泛研究，其因具有更短生存期和更突出的臨床病理特點而被看作獨立的臨床病種。這部分乳腺癌常表現為雌激素受體（estrogen receptor，ER）、孕激素受體（progesterone receptor，PR）、原癌基因人類表皮生長因子受體2（human epiderl growth factor receptor-2，HER2） 均陰性，且CK5/6和（或）EGFR表達陽性［1，2］。但基底細胞樣乳腺癌與三陰性乳腺癌（triple negative breast carcinoma，TNBC）并不完全相同［3～5］，根據基因表達譜分析，TNBC不僅包括基底細胞樣亞型，還包括正常乳腺樣型［6］，即TNBC中不表達CK5/6與EGFR的亞型（TN3BKE-）。有文獻報道該亞型對于新輔助化療敏感性不及BLBC，但預后較BLBC好［7～9］。

P-ERK（phospho-ERK），即磷酸化細胞外信號調節激酶，是ERK的活化形式。ERK信號途徑可被許多生長因子、細胞素及激素和介導有絲分裂、分化的信號所激活，發生磷酸化而活化，進而調節細胞周期并促進細胞增殖、分化，并能抵制細胞調亡。因此，ERK信號轉導途經的異常與腫瘤的發生發展密切相關［12］。本研究通過檢測BLBC與TN3BKE-中PERK的表達情況，探討BLBC與ERK/MAPK信號傳導通路的關系，意在進一步明確ERK途徑在BLBC發生發展及轉移中的意義，并為該亞型乳腺癌患者的預后提供有益的參考指標。

1 材料與方法

1.1 材料

收集中國醫科大學附屬第一醫院乳腺外科2006年1月至2009年12月存檔并且免疫組化檢測ER、PR及HER2均陰性的乳腺癌（即三陰性乳腺癌）病例70例，以上病例均由本院及同等級別醫院病理醫師對全部切片進行復查確診。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化：每例切片厚4μm，置于涂有蛋白膠的玻片上。用PV9000二步法進行免疫組化染色。選用以下單克隆抗體：ER、PR、HER2、PV9000試劑盒及DAB均購自北京中杉金橋生物開發有限公司。CK5/6、EGFR購自Abcam公司。P-ERK購自Santa公司。

1.2.2 陽性判定：實驗結果由兩位經驗豐富的病理醫師判定。陽性物質為棕黃色，CK5/6、ERFR陽性物質分別位于胞膜、胞質內［11］，P-ERK位于細胞核［12］，ER、PR位于細胞核，HER2位于細胞膜。陽性細胞數<5%為陰性，5%～25%為（+），26%～50%為（++），>50%為（+++）；ER按Allerd評分法；HER2按美國臨床腫瘤協會乳腺癌HER2檢驗指南判定。在數據分析時，將（+～+++）均歸為陽性組判斷。

1.2.3 統計分析：采用SPSS13.0軟件，采用χ2檢驗進行統計學分析。應用Spearman等級相關分析。

2 結果

2.1 BLBC、TN3BKE-的篩出

BLBC診斷標準：ER、PR、HER2均為陰性，且CK5/6和（或）EGFR表達陽性［1，2］。

TN3BKE-診 斷 標 準 ：ER、PR、HER2、CK5/6、EGFR均為陰性［9］。

按上述診斷標準在70例三陰性乳腺癌中共篩出BLBC53例，TN3BKE-17例。

2.2 CK5/6，EGFR在TNBC及BLBC中的表達

CK5/6在胞膜中表達（圖1A），在TNBC中陽性表達48例，陽性率為68.6%（48/70）；EGFR在胞漿中表達（圖1C），在TNBC中陽性表達40例，陽性率為57.1%（40/70）。篩出BLBC53例，其中CK5/6，EGFR在BLBC中陽性率分別為90.6%（48/53），75.5%（40/53）。

2.3 P-ERK在BLBC與TN3BKE-中的表達

本實驗顯示，P-ERK在胞核中表達（圖1B），在BLBC中陽性表達42例，陽性率為79.2%（42/53）,而在TN3BKE-中陽性表達8例，陽性率為47.1%（8/17），其差異有顯著意義（χ2=5.05，P<0.05）。

2.4 CK5/6、EGFR和P-ERK相關性分析

Spearman等級相關分析（表1）。

表1 CK5/6、EGFR和P-ERK相關性分析Tab.1 The correlate analysis between CK5/6，EGFRand P-ERK

圖1 CK5/6、EGFR及P-ERK在三陰性乳腺癌中的表達Fig.1 Expression of CK5/6，EGFRand P-ERKin triple negative carcinoma

3 討論

基底細胞樣乳腺癌是指具有基底細胞基因表型并不同程度的表達基底細胞角蛋白和肌上皮標志物的一種特殊類型的乳腺癌。Sorlie等［7］對多組基因芯片數據進行比較，將乳腺癌分為5種亞型，即管腔A型（luminal subtype A），管腔 B型（luminal subtype B）、正常乳腺樣型 （normal breast-like subtype）、HER2過表達型（HER2over-expression subtype）及基底細胞樣型（basal-like subtype）。BLBC約占全部乳腺癌的10%～20%，占高級別乳腺癌的25%。BLBC的臨床行為具有較高的增殖活性和高度的侵襲性。BLBC的轉移方式與其他乳腺癌也不盡相同，它們較少轉移到腋窩淋巴結和骨，而更傾向于通過血道轉移至腦和肺［13］。

目前，大多數學者認為CK5/6是確定BLBC最有效的標記物，本研究BLBC中CK5/6陽性率為90.6%，敏感性較高，因此CK5/6是診斷BLBC有價值的標記物。EGFR作為一種上皮生長因子受體，可能與細胞內信號激酶有關，特別是有絲分裂原活化的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MEK）和絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（AKT），他們與細胞增殖加速和細胞生存期延長密切相關，從而促進乳腺腫瘤的形成及發展，BLBC中EGFR高表達與其預后較差密切相關［14］。本研究BLBC中EGFR陽性率為75.5%，且均為強陽性表達，提示EGFR在BLBC的腫瘤發生發展中可能起重要作用。

ERK相關的細胞內信號傳導通路被認為是經典的MAPK信號傳導途徑?，F已證明多種細胞外信號通過不同的細胞內信號分子和信號通路活化ERK，傳統的ERK活化模式可簡單的概括為：各種生長因子、激素等→受體→Ras→Raf→MEK→ERK。Ras/Raf/MEK/ERK細胞信號傳遞通路是由一個小GTP蛋白連接活化的受體酪氨酸激酶和胞漿蛋白組成的級聯反應。ERK異?；罨瘜е录毎只⒌蛲龉δ艿膯适?，引起細胞惡性轉化、異常增殖、腫瘤發生、侵襲能力增強，ERK被磷酸化后，其活性增強100倍以上，最終導致腫瘤轉移。

有研究表明，非磷酸化的ERK在胞漿中與其上游的激活物MEK形成復合物，當ERK/MAPK通路被激活時，復合物解離，ERK被磷酸化而轉入核內。本研究顯示，P-ERK陽性信號位于細胞核內，在基底細胞樣乳腺癌中P-ERK的陽性率為79.2%，在非基底細胞乳腺癌中P-ERK的陽性率為47.1%，其差異有顯著意義（P<0.05）。說明基底細胞樣乳腺癌與ERK/MAPK信號傳導通路之間確有關系，表明ERK途徑的過度激活在基底細胞樣乳腺癌的發生發展中起著重要的作用。

本研究顯示CK5/6與EGFR有互相接近的陽性表達率，經統計學處理發現兩者之間有正相關關系。此外本研究還發現CK5/6與P-ERK在基底細胞樣乳腺癌的表達中具有正相關性，進一步提示基底細胞樣乳腺癌的發生發展與ERK/MAPK信號傳導通路被異常激活有關。

目前，腫瘤的治療愈趨個體化。然而，BLBC中ER、PR、HER2陰性表達，因此抗激素治療及赫賽?。℉erceptin）治療效果不佳。對于這類乳腺癌，唯一的治療方案為系統性化療，尋找新的治療靶點尚在摸索階段。希望本研究能夠指導臨床，對基底細胞樣乳腺癌患者通過藥物等干擾ERK/MAPK通路的激活，來阻斷腫瘤細胞的增殖和侵襲。

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（編輯 孫憲民，英文編輯 趙傳勝）

Relationship between Basal-like Breast Carcinoma and ERKSignal Transduction Pathway

LIChao1，GAOTing2，CHENGuang-quan3，YAOFan1，GEDan-mei4，JINFeng1
（1.Department of Breast Suregry，The First Affiliated Hospital，China Medical University，Shenyang 110001；2.The second laboratory，Cancer research Institutem The First Affiliated Hospital，China Medical University，Shenyang 110001；3.Department of Generral Sugery，The Fourth Hospital of People，Shenyang 110031；4.Departmet of Nephrology，The First Affiliated Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China）

ObjectiveTo detect the expression of CK5/6，EGFRand P-ERKin triple negative breast carcinoma and to probe into the relationship between basal-like breast carcinoma and ERK/MAPKsignal transduction pathway.MethodsTo detect the expression of CK5/6，EGFRand P-ERKin 70cases of triple negative breast carcinoma by using immunohistochemistry （IHC）.ResultsIn 70cases of triple negative carcinoma，the positive rates of CK5/6and EGFRwere 68.6%（48/70）and 57.1%（40/70）respectively，and a total of 53cases of basal-like breast carcinoma were screened out.In triple negative breast carcinoma，the positive rate of P-ERKin basal-like breast carcinoma and non-basal-like breast carcinoma were 79.2%（42/53）and 47.1%（8/17）respectively，their difference was of statistical significance（P<0.05）.There was a positive correlation among expression of CK5/6，EGFRand P-ERKin basal-like breast carcinoma（r=0.471；0.389，P<0.05）.ConclusionCK5/6and EGFRcan be used as important molecular markers for diagnosing basal-like breast carcinoma；occurrence and development of basal-like breast carcinoma relates to aberrant activation of ERK/MAPKsignal transduction pathway；and there is a correlation among expression of CK5/6，EGFRand P-ERKin basal-like breast carcinoma.

basal-like breast carcinoma；inmunohistochemistry；CK5/6；EGFR；P-ERK

R737.9

A

0258-4646（2010）12-1067-03

李超（1984-），男，碩士研究生.

金鋒，E-mail：jinfeng66cn@hotmail.com

2010-06-30