兔肝VX2移植瘤不同劑量高強度聚焦超聲輻照后增殖細胞核抗原的表達及意義

歐霞，王雁，鄒海蓉，鄒建中，李崇雁

（重慶市生物醫學工程學重點實驗室 重慶市超聲醫學工程重點實驗室，省部共建國家重點實驗室培育基地，重慶 400016）

高強度聚焦超聲（high-intensity focused ultrasound，HIFU）技術在腫瘤的治療中發揮了重要作用［1］，其劑量和療效是當前研究的熱點。增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）存在于細胞核中，其表達的高低和程度與腫瘤細胞增殖活性密切相關，乃目前公認的一個細胞增殖相關基因［2］。本研究檢測HIFU不同劑量輻照后腫瘤及與正常組織交界的PCNA表達情況，擬探討細胞增殖活性與HIFU輻照劑量的關系及意義，為HIFU臨床療效提供參考。

1 材料與方法

1.1 兔肝VX2移植瘤模型的建立

健康純種新西蘭大白兔72只（重慶醫科大學動物實驗中心提供），體質量1.5～2.0 kg，月齡2～3月，雌雄不限；VX2鱗癌細胞株瘤塊（日本Funbanski公司引進，重慶醫科大學超聲醫學研究所提供）。采用包埋法，將1 mm×1 mm×1 mm大小的瘤塊植于開腹后擬接種的兔肝右中葉，止血、關腹、縫合切口，即制成荷瘤兔。

1.2 實驗方法

輻照前1 d荷瘤兔禁食，前12 h禁水、備皮，術前5 min全麻后俯臥固定于手術臺，腹部完全浸入脫氣水。采用JC200型聚焦超聲腫瘤治療系統（重慶海扶（HIFU）技術有限公司研發，治療參數：治療頭頻率為1.03 MHz，直徑為158 mm，焦點處聲強ISATA最高可達19894.38 W/cm2），治療頭定位腫瘤，以“線-面-體”的方式，由深至淺逐漸覆蓋整個腫瘤組織，僅掃描一遍，速度為3 mm/s，兩線間距4 mm，每層間距3 mm。以聲功率表示該組劑量（各組實驗參數相同，每只腫瘤模型每立方厘米的輻照時間相同且最短），腫瘤模型按劑量平分為9個組，每組8只。

1.3 PCNA表達的檢測

輻照后24 h于靶區和腫瘤與正常組織交界處取材，PCNA免疫組化染色的具體方法按試劑盒說明進行（SABC法）。PCNA表達判斷標準：每例標本隨機選5張免疫組化切片，每張觀察5個高倍視野，計算每個視野下100個腫瘤細胞中的陽性細胞數，取其平均值作為PCNA的陽性表達率，以百分率表示；細胞核染色呈棕色為過表達，棕黃色為強表達，黃色為弱表達，正常情況下胞質及包膜不著色。

1.4 統計學處理

統計方法采用單向方差分析、t檢驗及相關性分析。使用SPSS 13.0統計軟件處理。

2 結果

2.1 PCNA陽性表達率

PCNA在VX2腫瘤靶區陽性率的表達隨輻照劑量的增加逐漸下降；交界組織PCNA陽性率先上升后下降，功率為100 W時，陽性率最高達（23.36±7.54）%，功率至180 W時，靶區及交界組織PCNA幾乎已無陽性表達（表1）。

表1 不同劑量HIFU輻照后PCNA陽性表達率的比較Tab.1 Comparison the expression of PCNA positive rate with different doses of HIFU irradiation

2.2 PCNA的表達程度及分布情況

VX2腫瘤靶區各組陽性細胞呈強表達或過表達，彌散、灶狀或片狀分布，陽性細胞中弱表達的比例隨輻照劑量的增加而增高（圖1）。交界組織陽性細胞包繞于腫瘤四周，基本為弱表達，強表達陽性細胞比例在80 W時達峰值（圖2）。

圖1 VX2兔肝移植瘤靶區組織PCNA免疫組化染色 ×400Fig.1 Observations of PCNA immunohistochemistry in VX2 rabbit liver tumor target tissues×400

圖2 VX2兔肝移植瘤與正常組織交界處PCNA免疫組化染色 ×400Fig.2 Observations of PCNA immunohistochemistry between the junction of VX2 rabbit liver tumor and normal tissues×400

2.3 線性相關性分析

輻照劑量為自變量，PCNA陽性表達率為因變量進行相關性分析。當功率小于100 W時，VX2腫瘤靶區PCNA陽性表達率與輻照劑量呈線性負相關，r為-0.956（P<0.01）；交界組織的 PCNA 陽性表達率與劑量變化有關，但非線性相關。

3 討論

一定強度的超聲波作用于組織細胞會使其產生相應的生物學效應，效應程度取決于聲波強度（聲功率）［3］。本研究發現，VX2腫瘤靶區PCNA陽性細胞表達率和強表達細胞比例均隨輻照劑量（功率）的增加而明顯下降至不表達，肯定了HIFU的治療效果；但腫瘤與正常組織交界處的陽性表達率和強陽性細胞表達比例卻分別于100 W、80 W時達峰值，可見HIFU輻照可誘導交界處PCNA的表達。Tam等［4］觀察到低強度超聲聲流明顯，可增強細胞膜通透性和細胞內外物質交換，作者發現在42℃時能促進PCNA表達、使肝細胞增殖［5］，根據熱平衡原理，超聲波作用于靶區的熱效應也會對靶組織周圍細胞產生影響。免疫組化結果證實在較低劑量時，靶區組織空泡較少以熱效應為主，并且交界處組織細胞核染色加深，而劑量增大靶區空泡也增多。

目前研究發現，低強度超聲可通過促進細胞內Ca2+離子濃度瞬間增強、整聯蛋白受體活化和ERK/ROCK/Rho信號途徑的開放等機制使生長因子表達增強，從而刺激細胞增殖［6，7］；但有學者認為低強度超聲并不能明顯促進細胞生長增殖［8］。出現這種顯著差異，可能和實驗儀器設備、超聲波輻照的參數、輻照方式、離體或者活體標本的選擇及活體組織的生物學特性不同有關。本實驗選用活體組織作為研究對象，以功率代替輻照劑量，結果顯示PCNA的陽性表達率與超聲輻照劑量之間在本實驗所選劑量范圍內沒有完整的線性關系，但靶區和交界處組織PCNA的表達規律確和劑量變化有關，最重要的原因可能就是超聲與活體組織間有信息反饋，是相互作用，并非單純的施加和接受的關系，而且不能排除整個機體調節和鄰近組織的影響。另一方面，輻照劑量（功率）繼續增加，交界處組織PCNA受到抑制，其陽性表達率也最終降至0%，說明達到一定劑量時，HIFU不僅能使靶區腫瘤細胞死亡，更能抑制甚至滅活腫瘤與正常組織交界處細胞。

本實驗以PCNA的變化規律作為評判方法，闡述HIFU輻照劑量和療效的關系，不僅說明HIFU是一種有效的腫瘤治療技術，更為臨床治療的劑量選擇提供了參考依據。

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