西咪替丁增強5-氟脲嘧啶對人胃癌細胞的生長抑制作用

劉芙蓉，張成宏，高建 ，李豐

（中國醫科大學 1.基礎醫學院細胞生物學教研室，細胞生物學衛生部重點實驗室；2.實驗技術中心，沈陽 110001）

西咪替丁增強5-氟脲嘧啶對人胃癌細胞的生長抑制作用

劉芙蓉1，張成宏1，高建2，李豐1

（中國醫科大學 1.基礎醫學院細胞生物學教研室，細胞生物學衛生部重點實驗室；2.實驗技術中心，沈陽 110001）

目的 觀察不同濃度的西咪替丁、5-氟脲嘧啶（5-Fu）單用或聯合應用對人胃癌細胞MGC-803、BGC-823生長及凋亡的影響。方法 用MTT法檢測西咪替丁與5-Fu聯合應用對胃癌細胞MGC-803、BGC-823存活率的影響；流式細胞儀檢測西咪替丁與5-Fu聯合應用對胃癌細胞凋亡率的影響。結果 西咪替丁與5-Fu聯合應用時，西咪替丁在無毒濃度（5～50μmol/L）即可顯著增強低濃度5-Fu對胃癌細胞的生長抑制作用。同時還發現，西咪替丁能增強5-Fu誘導胃癌細胞凋亡。結論 西咪替丁可提高人胃癌細胞MGC-803、BGC-823對化療藥物5-Fu的敏感性，抑制細胞增殖，促進細胞凋亡。

西咪替??；5-氟脲嘧啶；聯合應用；胃腫瘤細胞株

西咪替丁是一種H2受體阻斷劑，廣泛用于胃、十二指腸潰瘍和返流性食管炎的治療。5-氟脲嘧啶（5-fluorouracil，5-Fu）是非典型細胞周期特異性抗代謝類藥物，它不僅對癌細胞S期，對其他期亦有作用，已成為胃癌化療中的主要藥物。近些年來在臨床實驗研究中發現，西咪替丁與5-Fu聯合應用可明顯延長結直腸癌患者的生存率［1，2］。但聯合應用對胃癌細胞生長影響的實驗研究未見報道。本實驗觀察西咪替丁單用或與5-Fu聯合應用，對體外培養人胃癌細胞MGC-803、BGC-823生長抑制作用及細胞凋亡的影響，為臨床抗癌治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株：胃癌細胞株MGC-803、BGC-823由中國醫科大學細胞生物學教學研室提供。

1.1.2 主要試劑：西咪替丁（Cimetidine）、二甲基亞砜（DMSO）、碘化丙錠（PI）、Rnase、噻唑藍（MTT）（美國Sigma公司）；RPMI-1640培養基（美國Gibco BRL公司）；胎牛血清（天津 TBD）；5-Fu（上海旭東海普藥業公司）。

1.1.3 主要儀器：流式細胞儀 Facscalibur（美國BD公司）、超速離心機4K15（美國Sigma公司）、二氧化碳培養箱Thermo Forma（美國）、酶標儀Tecan（澳地利）、相差倒置顯微鏡NIKONTMS（日本）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養：用RPMI1640培養液（含10%胎牛血清、100U/ml青霉素、100U/ml鏈霉素），在37℃、5%CO2孵箱中常規培養。0.25%trypsin+0.02%EDTA消化傳代，取對數生長期細胞用于實驗。

1.2.2 藥物分組：據預試驗結果，將西咪替丁與5-Fu用RPMI1640培養液稀釋至所需濃度。實驗分3組（每組中各濃度段均設4個平行孔）：（1）西咪替丁組：西咪替丁濃度分別為 1、5、10、50、100、250、500μmol/L；（2）5-Fu 組：5-Fu 濃度分別為 10、50、100、200μmol/L；以上兩組均設對照（不加藥只加培養液）；（3）聯合組：除按5-Fu濃度外，每孔分別另加1、5、10、50μmol/L西咪替丁，并分別以相應濃度的西咪替丁和5-Fu作為對照。

1.2.3 MTT法：調整細胞數為1×105/ml，以每孔100μl接種于96孔培養板，每組設4個平行孔。藥物作用 24、48h 后，每孔加入 MTT20μl（5mg/ml），振蕩混勻。繼續培養4h后，棄上清液。每孔加入150μl DMSO，振蕩10min。選擇490nm波長，在自動酶標儀上測定各孔吸光度值（A），計算各組MGC-803、BGC-823細胞存活率。細胞存活率=（實驗組A值/對照組A值）×100%

1.2.4 細胞凋亡率檢測：不同濃度藥物作用48h后，胰酶消化收集細胞，吹打成單細胞懸液，PBS洗2次，細胞計數（細胞密度大于106/ml），加入70%冷乙醇4℃固定24h以上。PBS洗2次除盡乙醇，加RNaseA至終濃度0.5mg/ml，37℃溫育30mim。4℃PI染液至終濃度50μg/ml，暗室孵育1h。流式細胞儀檢測，每次計數2×104個細胞，以凋亡指數（APO）表示細胞凋亡情況。APO=（凋亡細胞數/所測細胞數）×100%

圖1 西咪替丁促進5-氟對胃癌細胞的生長抑制作用Fig.1 Cimetidine enhance the antiproliferative effect of 5-Fu

1.3 統計學處理

采用SPSS12.0軟件處理系統進行統計分析，實驗數據以±s表示，采用方差分析，組間比較用SLD法，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 西咪替丁對人胃癌細胞生長的影響

以不同濃度西咪替丁分別處理貼壁生長的人胃癌細胞24h、48h，結果發現250μmol/L以上濃度時胃癌細胞的生長受到明顯的抑制（P<0.05），并呈濃度和時間依賴性，濃度越大，時間越長，抑制作用越明顯；低于100μmol/L以下濃度則未見明顯的細胞毒作用。

2.2 聯合用藥對人胃癌細胞生長的影響

取低于100μmol/L的4個無毒西咪替丁濃度，觀察其與5-Fu聯合應用對人胃癌細胞生長的影響。結果如圖1A～D所示，單用5-Fu，可有效抑制人胃癌細胞MGC-803、BGC-823的生長，抑制作用呈濃度與時間依賴性；1、5、10、50μmol/L無毒濃度西咪替丁與 5-Fu聯合應用后，發現 5、10、50μmol/L西咪替丁在24h或48h均可顯著增強5-Fu對人胃癌細胞MGC-803、BGC-823的生長抑制作用（P<0.01），且在同一5-Fu濃度時，隨西咪替丁濃度的增加，抑制作用增強。同時還發現，5、10、50μmol/L西咪替丁與5-Fu聯合應用可有效降低5-Fu單用的IC50值（圖 2）。

2.3 聯合用藥對人胃癌細胞凋亡的影響

圖2 西咪替丁與5-氟聯合應用對胃癌細胞的5-Fu IC50值的影響Fig.2 The influence of 5-Fu IC50for cimetidine combination with 5-Fu

取 10、50μmol/L無毒濃度西咪替丁與 50、100、200μmol/L濃度5-Fu單用或聯合應用后，發現無毒濃度西咪替丁組與對照組比較，人胃癌細胞MGC-803、BGC-823的凋亡率無明顯影響（P>0.05），而50、100、200μmol/L5-Fu 組可使人胃癌細胞凋亡數增多，且可見典型凋亡峰，與對照組比較差異有統計學意義（P<0.01）。當不同濃度 5-Fu與 10、50μmol/L無毒濃度西咪替丁聯合應用時，與單用同等濃度5-Fu組比較，人胃癌細胞凋亡率均顯著增加（P<0.01），見表1。

表1 單用或聯合用藥對MGC-803、BGC-823凋亡率的影響（±s，n=3）Tab.1 The influence of apoptotic rate of MGC-803，BGC-823for cimetidine combination with 5-Fu（x ±s，n=3）

表1 單用或聯合用藥對MGC-803、BGC-823凋亡率的影響（±s，n=3）Tab.1 The influence of apoptotic rate of MGC-803，BGC-823for cimetidine combination with 5-Fu（x ±s，n=3）

1）Compared with control group，P<0.01；2）Compared with Relative Concentration 5-FU，P<0.01.

Group Concenration Apoptoticrate（%）5-FU（μmol/L） Cimetidine（μmol/L） MGC-803 BGC-8231000.82±0.17 0.71±0.23210 0.74±0.15 0.83±0.193050 0.94±0.10 0.89±0.160450 0 5.14±0.831） 4.67±0.671）5100 0 6.31±1.251） 8.91±1.741）6200 0 11.62±2.341） 14.13±2.161）750 10 8.43±1.221），2） 8.49±1.721），2）8100 10 10.78±1.731），2） 13.56±2.081），2）9200 10 18.89±3.531），2） 20.31±2.451），2）10 50 50 11.39±2.561），2） 10.97±2.461），2）11 100 50 18.32±3.741），2） 20.61±4.041），2）12 200 50 22.16±3.151），2） 26.79±3.781），2）

3 討論

西咪替丁是一種安全而有效的化學合成藥物。有研究表明西咪替丁可以明顯提高胃腸道癌癥患者的生存率［3，4］。相關研究認為，其抗腫瘤的重要機制可能是通過增強免疫系統各部分功能從而起到免疫調節的作用。具體為通過抑制T抑制性淋巴細胞（TS細胞）功能，增強輔助性T淋巴細胞（TH細胞）產生白介素（IL-2），以及促進天然殺傷細胞（NK細胞）活性等，從而提高機體的免疫能力和具抗腫瘤作用［5，6］，而 Rajendra 等［7］最新研究表明，西咪替丁可直接抑制結直腸癌細胞CaCo-2的增殖并促進其凋亡。與此同時Komatsubara等［8］經對結腸癌細胞系SW620及其耐藥細胞系SW620-Ad300的研究發現，西咪替丁在體外無免疫機制參與的條件下，即可顯著增強5-Fu對SW620的殺傷作用。在此基礎上，本實驗進一步研究了西咪替丁與5-Fu聯合應用對胃癌細胞MGC-803、BGC-823生長及凋亡的影響。

經用MTT法證實，100μmol/L以下的西咪替丁對人胃癌細胞MGC-803、BGC-823的生長無明顯抑制作用，只有其濃度高于250μmol/L時，才對癌細胞有顯著的生長抑制（P<0.01）。因此本實驗選用了1、5、10、50μmol/L這 4個無毒作用濃度的西咪替丁與5-Fu聯合應用，來更加確切地觀察聯合應用的效果。發現5、10、50μmol/L3個濃度的西咪替丁均能顯著提高小劑量 5-Fu（10、50、100、200μmol/L）的細胞殺傷作用，且在同一5-Fu濃度時，隨著西咪替丁濃度的增加，其對細胞的生長抑制作用增強。5-Fu是臨床上常用的化療藥，其抗腫瘤作用與其激活caspase-3，致使線粒體釋放細胞色素C，最終導致細胞凋亡有關［9］。因而，本實驗又研究了西咪替丁與5-Fu聯合應用時細胞凋亡率的變化。發現西咪替丁在無毒濃度下，即可顯著增強5-Fu誘導的胃癌細胞凋亡。提示西咪替丁增強5-Fu對胃癌細胞MGC-803、BGC-823的生長抑制作用可能是通過增強細胞凋亡途徑來實現的。有報道認為西咪替丁可被P-糖蛋白識別并泵出胞外［10，11］。P-糖蛋白是由MDR1基因編碼的，ATP依賴性跨膜糖蛋白，能將多種藥物泵出胞外，從而減弱藥物的細胞毒作用，產生耐藥性［12，13］。是否由于西咪替丁的競爭性抑制作用而使5-Fu的胞內濃度提高，從而增加其細胞毒作用仍有待進一步研究。

本研究表明，西咪替丁在無毒劑量時即可大大提高低劑量5-Fu對胃癌細胞MGC-803、BGC-823的殺傷作用，并達到較理想的效果。因此在臨床應用時可減低5-Fu用量，有可能使藥物毒副作用降低，對于克服腫瘤細胞對藥物的耐受性有一定的理論意義。盡管西咪替丁增強5-Fu生長抑制作用的機理仍有待進一步深入研究，但本研究為臨床聯合應用西咪替丁、5-Fu治療胃癌提供了理論基礎。

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（編輯 裘孝琦，英文編輯 趙傳勝）

Cimetidine Enhances the Antiproliferative Effects of 5-fluorouracil on Human Gastric Cancer Cells

LIUFu-rong1，ZHANGCheng-hong1，GAOJian2，LIFeng1
（1.Department of Cell Biology，The Key Laboratory of Cell Biology，Ministry of Public Health of China，College of Basic Medical Sciences，China Medical University，Shenyang 110001；2.Center of Experimental Technology，China Medical University，Shenyang 110001）

ObjectiveTo investigate the effect of cimetidine and 5-fluorouracil（5-Fu）lonely or combination on proliferation and apoptosis of human gastric cancer cells MGC-803，BGC-823in vitro.MethodsMTTassay was used to examine the effect of cimetidine and 5-Fu on the proliferation of MGC-803，BGC-823cells；flow cytometry was used for estimating apoptosis.ResultsWhen cimetidine used in combination with 5-Fu，cimetidine can significantly enhance the antiproliferative effect of lower concentration 5-Fu in no toxic concentrations（5～50μmol/L）on human gastric cancer cells.Meanwhile it also increased 5-Fu to induce the cells apoptosis.ConclusionCimetidine can increase the chemosensitivity of 5-Fu in human gastric cancer cells MGC-803，BGC-823in vitro，inhibit the cells proliferation and promote their apoptosis at higher degree.

cimetidine；5-Fu；combination；stomach neoplasms

Q279

A

0258-4646（2010）12-1021-03

劉芙蓉（1967-），女，實驗師，本科.

李豐，E-mail：fli@mail.cmu.edu.cn

2010-07-07

·短篇論著·