神經生長因子對骨癌痛大鼠疼痛行為學的影響

姚鵬，張錦，蔣晶晶，孟凌新

（中國醫科大學 附屬盛京醫院疼痛科，沈陽 110004）

神經生長因子對骨癌痛大鼠疼痛行為學的影響

姚鵬，張錦，蔣晶晶，孟凌新

（中國醫科大學 附屬盛京醫院疼痛科，沈陽 110004）

目的 觀察鞘內注射神經生長因子（NGF）及抗神經生長因子抗體（anti-NGF）對骨癌痛大鼠疼痛行為學的影響，探討NGF在骨癌痛中可能的作用。方法 建立大鼠脛骨骨癌痛模型，鞘內置管，并分別注入生理鹽水（cancer組）、NGF（cancer+NGF組）或anti-NGF（cancer+anti-NGF組），同時設立假手術組（sham組）。在不同時點觀察疼痛行為學變化。結果 與sham組比較，cancer各組大鼠體質量減輕；且cancer+anti-NGF組大鼠體質量比cancer組大鼠增加。與sham組比較，cancer組大鼠自發縮足次數增多，縮爪潛伏期（PWL）縮短，縮爪閾值（PWT）降低；與cancer組比較，cancer+anti-NGF組大鼠縮足次數明顯減少，PWL延長，PWT增高；而cancer+NGF組大鼠與cancer組比較，縮足次數增多，PWL縮短，PWT降低。結論 NGF可加劇大鼠骨癌痛，而anti-NGF可顯著減弱骨癌痛大鼠的痛敏。

骨癌痛；神經生長因子；疼痛行為學；鞘內注射；大鼠

腫瘤發病率呈逐年上升趨勢，2010年Thun等［1］統計結果顯示，腫瘤已成為危及人類生命的首要原因之一，如何改善腫瘤患者的生存質量成為當前亟需解決的問題。腫瘤骨轉移性疼痛多由乳腺癌、前列腺癌及肺癌轉移引起，原發性骨肉瘤等也易誘發骨癌痛，嚴重干擾了患者的日常生活，并導致患者體能狀態下降及焦慮或抑郁發生。但是對于這種慢性疼痛的產生和維持機制，我們卻知之甚少。

骨癌痛是一種復雜的疼痛綜合征。研究發現，骨癌痛的疼痛信號傳導與炎癥痛和神經病理性痛不同。骨癌痛模型中最具特征的改變是脊髓背角星形膠質細胞標記物膠質原纖維酸性蛋白大量表達［2］，脊髓全層尤其是背角淺層膠質細胞大量增生和過度肥大。脊髓的興奮性明顯上調，傷害性感受野擴大，神經元對機械、熱、電刺激反應顯著增強［3］。但骨癌痛的機制研究遠遠滯后于其他疼痛類型。因此，需要進一步研究骨癌痛的病理機制以指導臨床治療。本研究建立大鼠脛骨骨癌痛模型，進行疼痛行為學及放射線、病理學觀察；鞘內注射神經生長因子（nerve growth factor，NGF）及抗神經生長因子抗體（anti-NGF），觀察其對疼痛行為學的影響，探討NGF在骨癌痛中可能的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雌性SD大鼠，初始體質量200～220g，由中國醫科大學附屬盛京醫院動物室提供。飼養于鋪墊鋸末塑料盒內，每籠 5只，室內溫度（22±0.5）℃，濕度40%～60%，自然照明，自由攝食、飲水。實驗獲得中國醫科大學附屬盛京醫院倫理委員會批準。

1.2 實驗分組及給藥

60只雌性SD大鼠，隨機分成4組：假手術組（sham 組）、骨癌痛模型組（cancer組）、cancer+NGF組和cancer＋anti-NGF組，每組15只。sham組大鼠脛骨注入PBS液；cancer各組注入Walker 256細胞。所有動物在模型建立后13d開始進行鞘內置管。置管后3d（注入瘤細胞后16d），sham組及cancer組鞘內注入生理鹽水（10μl/只）；cancer+NGF組鞘內注入NGF（10μl/只，用生理鹽水稀釋為0.1μg/μl），cancer＋anti-NGF組鞘內注入 anti-NGF（10μl/只，用生理鹽水稀釋為 1μg/μl），每日 2次，連續5d，置入導管容量10μl，熱凝封管。觀察大鼠疼痛行為學變化，并通過病理組織切片觀察瘤細胞生長情況，數字化攝像觀察骨質破壞情況。

1.3 主要儀器和試劑

Walker 256細胞（中國醫學科學院腫瘤研究所），von Frey細絲（美國Stoeling公司），BME-410A熱輻射刺激儀（中國醫學科學院生物工程研究所），銀汞混合器（北京四泰新技術開發公司），NGF（ab66458，Abcam 公司），anti-NGF（Santa Cruz公司）。

1.4 瘤細胞提取

Walker 256細胞為來源于大鼠乳腺癌的腹水瘤細胞，保存在中國醫科大學附屬盛京醫院中心實驗室液氮罐中，用快融方法復蘇并接種。

1.5 大鼠脛骨癌痛模型的建立及鞘內置管

根據Medhurst等［4］的方法建立大鼠脛骨骨癌痛模型。選用體質量為200～220g的雌性SD大鼠，經水合氯醛麻醉后，左側后肢外側剪毛，消毒，在脛骨上段將皮膚切開約1cm小口，小心暴露脛骨，先用5ml注射器針頭在脛骨鉆孔，用彎曲的1ml注射器針頭輕柔探測骨髓腔，然后用25μl微量注射器順針孔進入骨髓腔，緩慢注入10μl含Walker 256的PBS細胞懸液，共含癌細胞1×105個，注射時間為2min，注射完畢后迅速用銀汞合劑封住針孔，分別用75%乙醇和無菌生理鹽水沖洗切口，皮膚分層縫合。sham組大鼠左側脛骨上段注入等體積的PBS液，其余操作同各cancer組。鞘內置管參考陳華等［5］的方法置管，注入2%利多卡因20μl，7～20s出現雙后肢麻痹后30min左右恢復，證實置管成功，取無感覺和運動障礙的動物作為研究對象。

1.6 行為學觀察

1.6.1 一般情況觀察：動物術后單籠飼養，以免互相啃噬，注意觀察體位、走路姿態、有無自噬行為、后肢持重及體質量等情況。

1.6.2 行走步態及自發縮足次數觀察：大鼠置于透明有機玻璃箱內，在其中可以自由行走。觀察2min內大鼠行走步態和左后肢的自發縮足次數情況。

1.6.3 熱輻射潛伏期測定：測定熱輻射刺激引起的縮爪潛伏期（paw withdrawal latency，PWL）。將大鼠置入觀察籠內，待其安靜后將光輻射焦點對準足趾底中部，打開光源，從照射開始至大鼠縮爪的潛伏期作為熱痛閾值，測定3次，時間間隔10min，取其平均值。為防止燙傷，將PWL上限值定為20s。每只大鼠在建立模型前1d測定的PWL作為基礎值。

1.6.4 機械性痛閾測定：測定縮爪閾值（paw withdrawal threshold，PWT）。安靜室溫環境中，機械性痛覺超敏采用von Frey細絲測定，采用Chaplan等［6］的“up and down”方法。

1.7 放射學研究

于造模后第7、13和21天分別進行X線攝片，評估腫瘤誘發的骨破壞程度。放射學評分標準如下：0分，正常的骨結構，無任何骨質破壞的征象；1分，在脛骨近骺端注射部位附近見小的放射性的骨質缺損病灶（≤3個）；2分，髓質骨缺損放射性病灶增多（>3個）；3分，髓質骨缺失，同時皮質骨受侵；4分，單面的骨皮質完全缺損；5分，雙面的骨皮質缺失，移位性骨折。

1.8 組織學研究

大鼠后肢X線攝片結束后進行修剪，留下脛骨及周圍少量肌肉組織。先用4%多聚甲醛液固定1周，再在含5%甲酸的多聚甲醛固定液中脫鈣4周，6mm厚連續切片，石蠟包埋，HE染色，鏡下觀察腫瘤生長和骨結構的破壞情況。

1.9 統計學分析

2 結果

2.1 大鼠一般情況

sham組大鼠無死亡；cancer組1例置管后出現肢體癱瘓，1例死亡；cancer+NGF組2例死亡；cancer+anti-NGF組1例死亡，1例置管后出現肢體癱瘓。上述死亡及肢體癱瘓大鼠均排除本研究之外。

2.2 大鼠體質量變化

cancer組大鼠接種Walker 256瘤細胞后毛發缺乏光澤，接種13d后，經常左后足懸空或不敢著地，右后肢負重，基本停止生長，與sham組比較體質量的差異有統計學意義（P<0.05）。cancer+anti-NGF組與cancer組比較，大鼠體質量明顯增加（P<0.05），其原因可能與anti-NGF緩解疼痛有關。見表1。

表1 接種Walker 256瘤細胞后各組大鼠體質量變化（±s，g）Tab.1 Changes in rat body weight after inoculation of Walker 256tumor cell in each group（±s，g）

1）P<0.05vs sham group；2） P<0.05vs cancer group.

Group Baseline Post-inoculation day 7 Post-inoculation day 13 Post-inoculation day 16 Post-inoculation day 18 Post-inoculation day 21Sham 219±6.1 225±7.1 235±6.8 237±4.1 239±4.8 243±8.1Cancer 219±8.1 222±6.4 219±8.1 223±8.31） 218±6.91） 219±4.81）Cancer＋NGF 220±7.9 223±6.9 220±7.9 221±5.41） 219±7.41） 215±9.21）Cancer＋anti-NGF 219±8.3 222±5.8 219±8.3 223±7.51） 226±6.61），2） 228±4.91），2）

2.3 自發縮足次數

cancer組大鼠從接種瘤細胞1周左右開始，自發縮足次數明顯高于sham組（P<0.01）；接種瘤細胞18d后，cancer+anti-NGF組大鼠縮足次數明顯少于cancer組（P<0.01），而cancer+NGF組大鼠縮足次數多于cancer組大鼠。見表2。

表2 接種Walker 256瘤細胞后各組大鼠自發縮足次數變化（±s）Tab.2 Changes in the number of paw withdrawal response after inoculation of Walker 256tumor cell in each group（±s）

表2 接種Walker 256瘤細胞后各組大鼠自發縮足次數變化（±s）Tab.2 Changes in the number of paw withdrawal response after inoculation of Walker 256tumor cell in each group（±s）

1）P<0.01vs sham group；2）P<0.05，3）P<0.01vs cancer group.

Group Baseline Post-inoculation day 7 Post-inoculation day 13 Post-inoculation day 16 Post-inoculation day 18 Post-inoculation day 21Sham 2.3±0.4 2.5±0.5 3.0±0.6 3.1±0.5 2.8±0.4 2.9±0.4Cancer 2.2±0.6 3.6±0.7 12.2±1.81） 18.6±2.11） 22.3±3.11） 24.1±3.61）Cancer＋NGF 2.3±0.4 3.5±0.6 12.4±0.91） 17.1±1.41） 25.8±3.91），2） 29.3±5.41），2）Cancer＋anti-NGF 2.3±0.5 3.8±0.8 13.1±1.11） 17.2±1.51） 8.9±1.61），3） 6.7±1.21），3）

2.4 PWL和PWT的測定

cancer組大鼠在接種瘤細胞1周左右開始出現PWL及PWT縮短或降低的趨勢；接種后13d，cancer組大鼠的PWL縮短，PWT降低，與sham組比較差異有統計學意義（P<0.05或0.01），提示大鼠脛骨接種Walker 256瘤細胞可導致大鼠同時出現機械性痛敏和熱痛敏。與cancer組比較，cancer+NGF組大鼠PWL和PWT進一步縮短或降低（P<0.05），提示NGF可加劇cancer大鼠的痛敏；而 cancer+anti-NGF組與 cancer組比較，PWL和PWT均延長或增高（P<0.05），提示機械性痛敏和熱痛敏顯著減弱。見表3、表4。

表3 接種Walker 256瘤細胞后各組大鼠PWL變化（±s，s）Tab.3 Changes in PWLafter inoculation of Walker 256tumor cell in each group（x ±s，s）

表3 接種Walker 256瘤細胞后各組大鼠PWL變化（±s，s）Tab.3 Changes in PWLafter inoculation of Walker 256tumor cell in each group（x ±s，s）

1）P<0.05，2）P<0.01vs sham group；3）P<0.05，4）P<0.01vs cancer group.

Group Baseline Post-inoculation day 7 Post-inoculation day 13 Post-inoculation day 16 Post-inoculation day 18 Post-inoculation day 21Sham 12.3±1.3 11.3±1.4 12.6±1.3 11.2±1.5 11.5±1.3 10.9±1.3Cancer 12.2±1.4 10.1±1.2 8.3±1.11） 8.4±0.81） 7.1±0.51） 3.8±0.52）Cancer＋NGF 12.5±1.5 9.9±1.1 8.7±0.91） 8.7±0.91） 5.9±0.52），3） 3.3±0.42）Cancer＋anti-NGF 13.1±1.4 10.2±1.2 8.6±0.81） 8.6±0.81） 9.3±0.63） 9.7±1.24）

表4 接種Walker 256瘤細胞后各組大鼠PWT變化（±s，g）Tab.4 Changes in PWTafter inoculation of Walker 256tumor cell in each group（x ±s，g）

表4 接種Walker 256瘤細胞后各組大鼠PWT變化（±s，g）Tab.4 Changes in PWTafter inoculation of Walker 256tumor cell in each group（x ±s，g）

1）P<0.05，2）P<0.01vs sham group；3）P<0.05，4）P<0.01vs cancer group.

Group Baseline Post-inoculation day 7 Post-inoculation day 13 Post-inoculation day 16 Post-inoculation day 18 Post-inoculation day 21Sham 15.7±2.4 14.9±2.4 13.2±2.3 12.4±2.2 11.7±1.9 12.3±1.3Cancer 16.3±2.5 13.4±2.2 5.6±1.22） 4.3±0.82） 3.7±0.92） 3.2±1.12）Cancer＋NGF 15.9±2.3 13.7±2.1 5.9±0.92） 5.1±0.92） 2.1±0.52），3） 1.8±0.32），3）Cancer＋anti-NGF 16.3±1.9 14.3±2.0 5.8±1.12） 6.6±0.72），3） 10.9±2.34） 9.7±1.51），4）

2.5 放射線顯像結果

sham組大鼠沒有發現放射線改變（放射學評分0分）。cancer組大鼠在接種瘤細胞后7d，脛骨近骺端出現骨質破壞；接種后13d，大鼠接種側脛骨出現明顯的髓質骨破壞；接種后21d骨破壞程度進一步加重，大部分骨皮質缺損破壞、個別出現移位性骨折，腫瘤組織突破骨皮質，能觀察到明顯的異常軟組織影。cancer+NGF組及cancer+anti-NGF組大鼠術后21d左脛骨骨皮質均嚴重缺損破壞，骨不連，瘤細胞突出骨髓腔，cancer組、cancer+NGF組和cancer+anti-NGF組3組大鼠骨質破壞程度無明顯差異。見表5。

表5 接種Walker 256瘤細胞后各組大鼠骨破壞程度評分（±s）Tab.5 Changes in the degree of bone destruction after inoculation of Walker 256tumor cell in each group（x ±s）

表5 接種Walker 256瘤細胞后各組大鼠骨破壞程度評分（±s）Tab.5 Changes in the degree of bone destruction after inoculation of Walker 256tumor cell in each group（x ±s）

Group n Post-inoculation day 7 Post-inoculation day 13 Post-inoculation day 21Sham 15 0 0 0Cancer 13 1.54±0.23 2.66±0.54 4.27±0.63Cancer＋NGF 13 1.57±0.29 2.75±0.58 4.81±0.73Cancer＋anti-NGF 13 1.62±0.31 2.47±0.55 4.22±0.81

2.6 病理學改變

光鏡下觀察顯示cancer各組大鼠注射側脛骨骨髓腔內及骨小梁間被大量腫瘤細胞填充，腫瘤細胞生長活躍，有成熟的、多形核破骨細胞浸潤，骨結構破壞。sham組大鼠骨髓腔內見各種正常的骨髓細胞，無異常骨結構的改變。

3 討論

本研究結果表明，脛骨上段骨髓腔注入Walker 256大鼠乳腺癌細胞后，cancer組大鼠自發縮足次數增多，機械性痛閾降低，熱輻射痛刺激PWL縮短，放射顯像及病理組織切片均表明脛骨癌痛模型成功建立。目前大鼠及小鼠各種骨癌痛模型已經成功建立，其區別在于腫瘤細胞的接種位點（包括股骨、肱骨、脛骨及跟骨等骨髓腔內）以及腫瘤細胞的組織學來源上存在一定的差異，但其共同的特征［7］在于：（1）行為學：通過自發性的保護或畏縮動作，在預定的觀察時間內抬高患肢的時程或頻率增加所體現的“進行性痛”或“背景痛”，在空曠區域內自由活動或強迫性運動時患肢使用率降低所體現的“移動誘發痛”；（2）組織學和影像學：腫瘤局部有成熟的、多形核破骨細胞浸潤。骨質破壞的程度和疼痛行為學反應、外周及中樞神經系統內神經化學物質、細胞及分子的改變密切相關。

建立骨癌痛模型，不管使用何種腫瘤細胞、接種的位點在何處，模型成功的關鍵在于確保腫瘤細胞局限于骨髓腔內而不侵及鄰近的軟組織，否則直接影響骨關節和肌肉的功能，給行為學分析帶來困難。本研究按照Medhurst等的方法建立骨癌痛模型，并采用牙科專用銀汞合金封堵骨孔，75%乙醇和無菌生理鹽水沖洗切口，確保了局部關節、肌肉組織無瘤細胞殘留。13d左右無鄰近的軟組織腫物出現，但隨后有15%左右大鼠出現局部腫物生長，考慮與瘤細胞破壞骨組織、侵及鄰近組織有關。

本研究發現，骨癌痛大鼠熱輻射潛伏期縮短，機械痛閾值降低，出現痛敏。鞘內注射anti-NGF抗體阻斷NGF的作用位點后，熱輻射潛伏期延長，機械痛閾提高，自發縮足次數減少，而鞘內使用NGF卻可加劇骨癌痛大鼠的痛敏反應。這些結果顯示NGF在大鼠乳腺癌骨轉移痛時發揮重要作用。以往的一些基于骨腫瘤的研究顯示，腫瘤細胞在骨髓腔內不斷生長，腫瘤細胞本身會釋放NGF；腫瘤浸潤組織的白細胞增多，有研究認為占整個腫瘤組織的80%，活化的白細胞會合成并釋放大量高濃度的生長因子；腫瘤細胞壞死，受侵的正常組織細胞也會釋放生長因子。因此在高濃度的生長因子作用下，感覺神經元的表型及反應特性均會發生明顯的變化。

Zahn等［8］的研究顯示，阻斷NGF通路，熱痛覺超敏減弱，而機械痛敏無變化。本研究結果顯示，鞘內使用anti-NGF后，骨癌痛大鼠熱痛敏及機械痛敏反應均減弱，提示阻斷NGF通路可產生明顯的抗傷害感受作用。與以往研究不一致之處考慮可能與使用anti-NGF的持續時間有關，本研究中連續應用5d，而Zahn等的研究僅是單次用藥。

NGF在傷害性感受器的急、慢性敏化過程中發揮重要作用。當發生炎性損傷或使用致炎因子白介素1β和腫瘤壞死因子α后，NGF在局部組織中的濃度會迅速升高，導致部分肽能傷害性感受器發生敏化，出現痛敏。電生理研究發現，傷害性感受器的興奮性與NGF的含量密切相關。NGF不僅可直接活化感覺神經元，還可調控一些神經遞質、受體、通道的活性。有研究提示，NGF可促進前列腺癌細胞在骨髓的遷延、破壞，加劇痛敏發生［9］，與本研究結果一致。因此，NGF在腫瘤骨轉移疼痛的發生、發展過程中發揮重要作用，阻斷NGF的作用位點可能是緩解骨癌痛的一種新的治療方案。

今后，將繼續研究NGF在骨癌痛發生、發展過程中的作用及其與相關受體、通道的關聯及機制。

［1］Thun MJ，DeLancey JO，Center MM.The global burden of cancer：priorities for prevention［J］.Carcinogenesis，2010，31（1）：100-110.

［2］King T，Vardanyan A，Majuta L，et al.Morphine treatment accelerates sarcoma-induced bone pain，bone loss，and spontaneous fracture in a murine model of bone cancer［J］.Pain，2007，132（1-2）：154-168.

［3］Khasabov SG，Hamamoto DT，Harding-Rose C，et al.Tumor-evoked hyperalgesia and sensitization of nociceptive dorsal horn neurons in a murine model of cancer pain［J］.Brain Res，2007，14（1180）：7-19.

［4］Medhurst SJ，Walker K，Bowes M，et al.Arat model of bone cancer pain［J］.Pain，2002，96（1-2）：129-140.

［5］陳華，張錦，崔健君，等.鞘內應用嗎啡和氯胺酮對神經痛大鼠脊髓NOS活性和NO產量的影響［J］.中華麻醉學雜志，2004，24（3）：203-205.

［6］Chaplan SR，Bach FW，Pogrel JW，et al.Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw ［J］.JNeurosci Meth，1994，53（1）：55-63.

［7］Goblirsch MJ，Zwolak PP，Clohisy DR.Biology of bone cancer pain［J］.Clin Cancer Res，2006，12（20Pt 2）：6231s-6235s.

［8］Zahn PK，Subieta A，Park SS，et al.Effect of blockade of nerve growth factor and tumor necrosis factor on pain behaviors after plantar incision［J］.JPain，2004，5（3）：157-163.

［9］Sato S，Futakuchi M，Ogawa K，et al.Transforming growth factor beta derived from bone matrix promotes cell proliferation of prostate cancer and osteoclast activation-associated osteolysis in the bone microenvironment［J］.Cancer Science，2008，99（2）：316-323.

（編輯 陳 姜，英文編輯 陳 姜）

Effect of Nerve Growth Factor on Pain Behavior in Rat Model of Bone Cancer Pain

YAOPeng，ZHANGJin，JIANGJing-jing，MENGLing-xin
（Department of Pain，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110004，China）

ObjectiveTo observe the effect of nerve growth factor （NGF）and anti-NGFinjected intrathecally on pain behavior in rat model of bone cancer pain.MethodsThe rat model of bone cancer pain was established，and randomly assigned to receive intrathecal injection of normal saline（cancer group），NGF（cancer+NGFgroup），and anti-NGF（cancer+anti-NGFgroup）.The changes in mechanical and thermal hyperalgesia were assessed at different time points after inoculation of Walker 256tumor cell.ResultsCompared with shamoperated group，the body weight of rats in other 3groups significantly decreased（P<0.05）；and the body weight of rats in cancer+anti-NGFgroup was significantly higher than that in cancer group （P<0.05）.Compared with sham-operated group，more paw withdrawal responses，reduced paw withdrawal latency （PWL），and decreased paw withdrawal threshold （PWT）were observed in cancer group.Compared with cancer group，the number of paw withdrawal response decreased，and PWLand PWTincreased in cancer+anti-NGFgroup；but in cancer+NGFgroup the number of paw withdrawal response increased，and PWLand PWTdecreased.ConclusionNGFcould deteriorate cancerinduced bone pain in rats，while anti-NGFcould ameliorate the mechanical and thermal hyperalgesia.

bone cancer pain；nerve growth factor；pain behavior；intrathecal injection；rat

R338

A

0258-4646（2010）12-1009-04

遼寧省自然科學基金資助項目（20082111）

姚鵬（1971-），男，講師，博士.

張錦，E-mail：yaop@sj-hospital.org

2010-09-26