GST/RIPX融合蛋白表達載體的構建及其在大腸埃希菌中的表達

王孝會，王桂玲

（中國醫科大學 基礎醫學院細胞生物學教研室，衛生部細胞生物學重點實驗室，沈陽 110001）

GST/RIPX融合蛋白表達載體的構建及其在大腸埃希菌中的表達

王孝會，王桂玲

（中國醫科大學 基礎醫學院細胞生物學教研室，衛生部細胞生物學重點實驗室，沈陽 110001）

目的 構建GST/RIPX融合蛋白基因表達載體，并在大腸埃希菌（E.coli）中誘導表達。方法 以質粒pcDNA3.1-RIPX為模板，通過BamH1和Xho1酶切位點將RIPX定向插入pGEX-4T-2中，構建原核表達質粒pGEX-4T-2-RIPX，并轉化E.coliDH5α，篩選陽性重組子，限制性內切酶酶切鑒定和DNA序列測定正確后，轉入化E.coliBL21中，異丙基硫代β-D半乳糖苷誘導表達，鑒定。結果 酶切及測序結果證明，成功構建了原核表達質粒pGEX-4T-2-RIPX，并用SDS-PAGE方法證實了GST/RIPX融合蛋白的表達。結論 成功構建了RIPX原核表達載體，并證實了融合蛋白的表達，為進一步純化RIPX蛋白和研究RIPX的生物學功能奠定了基礎。

質粒；原核表達；融合蛋白；RIPX

RIPX（Rap2interaction protein X） 又名 KIAA0871，屬于KIAA基因家族成員，人的RIPXcDNA全長為4304bp，ORF全長為1460bp，編碼蛋白為469氨基酸。該蛋白含有一個RUN結構域，在腦組織中存在高表達，與神經軸突形成相關［1］。RIPX同源蛋白包括Rap2相互作用蛋8（RPIP8）和Rap2相互作用蛋白 9（RPIP9）［2，3］。該蛋白家族能夠通過與Rap和Rab家族蛋白相互作用而影響相關通路［3～5］，但目前其具體作用方式及其產生的生物學效應還不明確。

為了進一步研究RIPX的功能及具體作用機制，我們利用基因重組技術成功構建了RIPX的原核表達載體，將其導入E.coliBL21中進行誘導表達，并進一步對其表達情況進行鑒定，為今后研究RIPX的生物學功能奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌DH5α和BL21為本實驗室保存，原核表達載體pGEX-4T-2購自美國Clontech公司；各種限制性內切酶﹑電泳凝膠回收試劑盒均購自TakaRa公司；T4DNA連接酶購自NEB公司，蛋白質分子質量標準購自MBI公司，異丙基硫代-D半乳糖苷（IPTG）為Amresco公司產品。DNA測序由南京金斯瑞公司完成。

1.2 RIPX原核表達載體的構建

將pcDNA-RIPX載體用Xho1和Bam1雙酶切后，凝膠回收純化產物后，與經同樣酶切處理的原核表達載體p GEX-4T-2用T4-DNA連接酶連接16℃過夜，得到連接產物。取5ul上述連接反應液轉化感受態細胞E.coliDH5α中，涂布于含氨芐西林的LB瓊脂平板，37℃過夜培養過夜。挑取單克隆菌落接種于氨芐西林3ml的LB培養液中，37℃震蕩過夜。用堿裂解法制備質粒DNA，用Xho1和Bam1雙酶切鑒定重組質粒，并送生物公司測序，經測序正確后，將構建質粒命名為GST-RIPX。

1.3 重組質粒的誘導表達

將測序正確的重組質粒p GEX-4T-2-RIPX轉化大腸埃希菌BL21涂布于LB瓊脂平板，37℃培養過夜。各挑取單菌落5個，堿裂解法提取質粒DNA，利用BamN1和Xho1雙酶切后鑒定陽性克隆。將陽性克隆接種到含氨芐霉素的LB培養基中，37℃過夜培養。

1.4 SDS-PAGE凝膠分離

將過夜培養含陽性克隆的菌液按1∶100稀釋，37℃培養至OD600為0.6左右時，加入終濃度1mmol/L的IPTG30℃誘導培養3h時，收集菌體，加入 100μl 1×SDS緩沖液中，100℃加熱 5min，12000r/min離心5min，冰上放置，取上清進行10%SDSPAGE電泳。電泳結束后進行考馬斯藍染色，脫色后觀察電泳結果，發現誘導3h即可達到理想效果。

1.5 Western blot分析

將上述誘導表達后的蛋白經10%SDS-PAGE凝膠分離，恒流轉移至PVDF膜上，4℃過夜，用5%脫脂奶粉封閉3h，TBST洗膜10min 3次，加入GST抗體（Cell Signaling 公司，1∶2000），室溫 1.5h，TBST洗膜10min 3次，加入辣根過氧化物酶標記的二抗（1∶5000） 室溫 2h，TBST洗膜 10min 3次，ECL顯色，壓片。

2 結果

2.1 pGEX-RIPX重組質粒的酶切鑒定

將重組質粒pGEX-4T-2-RIPX經Xho1和BamH1雙酶切后得到約4.9kb和1.5kb左右的兩條帶，與預期結果相符（圖1），并經測序鑒定正確，無移碼突變。

2.2 原核表達質粒在大腸桿菌中的誘導表達

將構建的原核表達質粒pGEX-4T-2-RIPX及空載體pGEX-4T-2分別轉化大腸桿菌BL21中，挑取單菌落進行誘導表達，利用10%的SDS-PAGE電泳進行分離，其中重組質粒pGEX-4T-2-RIPX在70kDa附近出現一明顯的特異性蛋白帶，其分子量與預期相符（圖3）。

2.3 Western blot分析純化后GST-RIPX融合蛋白

圖1 pGEX-RIPX重組質粒的酶切鑒定結果Fig.1 Restrictin enzyme digestion analysis of the recombinant plasmid pGEX-RIPX

圖2 pGEX-RIPX重組質粒的測序鑒定結果Fig.2 The sequencing result of the recombinant plasmid pGEXRIPX

圖3 SDS-PAGE分析GST-RIPX蛋白在大腸桿菌BL21中的誘導表達Fig.3 SDS-PAGEanalysis of the induction expression of GSTRIPXfusion proteins in E.coliBL21

我們利用10%SDS-PAGE電泳后，經Western blot分析，利用GST單克隆抗體檢測，結果可見在分子量為70kDa附近出現條帶，分析為質粒本身的谷胱甘肽轉移酶（GST）分子量（26kDa）和RIPX分子量之和，說明表達了GST-融合蛋白，與預期結果一致。

3 討論

隨著人類基因組計劃的完成，對未知蛋白質的鑒定和功能研究已經成為后基因組計劃的主要研究內容。RIPX是近年來發現和克隆的人類基因，又名KIAA0871，屬于KIAA基因家族成員。因其編碼的蛋白與Rap和Rab家族中GTP酶功能相關的蛋白有相同的結構域，RIPX可能在Ras-like GTPase信號轉導通路中發揮重要的作用［6］。

圖4 GST-RIPX融合蛋白經純化后SDS-PAGE后考馬斯亮藍染色分析Fig.4 SDS-PAGEanalysis of GST-RIPXfusion protein

為了進一步研究RIPX的生物學功能，構建RIPX的原核表達載體是關鍵之一。在本研究中，我們成功構建了RIPX原核表達載體，轉入大腸桿菌后，用IPTG進行誘導表達。通過純化，我們獲得了原核表達的GST–RIPX融合蛋白。在進行原核細胞表達時，目前多以融合蛋白為表達形式的載體，這樣既有利表達蛋白的純化，又可防止宿主菌蛋白酶對表達蛋白的降解，保護目的蛋白的活性。表達的融合蛋白進一步可通過谷胱甘肽Beads結合吸附，從而獲得原核表達的目的蛋白。本實驗研究結果將為進一步尋找RIPX新的相互作用蛋白，探討其生物學功能及具體機制奠定基礎。

［1］Mori T，Wada T，Suzuki T，Kubota Y，et al.Singar1，a novel RUNdomain-containing protein，suppresses formation of surplus axons for neuronal polarity［J］.JBiol Chem，2007，282（27）：19884-19893.

［2］Janoueix-Lerosey I，Pasheva E，de Tand MF，et al.Identification of a specific effector of the small GTP-binding protein Rap2［J］.Eur JBiochem，1998，252（2）：290-298.

［3］Wang S，Zhang Z，Ying K，et al.Cloning，expression，and genomic structure of a novel human Rap2interacting gene （RPIP9）［J］.Biochem Genet，2003，41（1-2）：13-25.

［4］Kukimoto-Niino M，Takagi T，Akasaka R，et al.Crystal structure of the RUNdomain of the RAP2-interacting protein x［J］.Biol Chem，2006，281（42）：31843-31853.

［5］Yoshida H，Okumura N，Kitagishi Y，et al.Rab5（Q79L） interacts with the carboxyl terminus of RUFY3［J］.Int JBiol Sci，2010，6（2）：187-189.

［6］Zhao AG，Li T，You SF，et al.Effects of Wei Chang An on expression of multiple genes in human gastric cancer grafted onto nude mice［J］.World JGastroenterol，2008，14（5）：693-700.

（編輯 孫憲民，英文編輯 趙傳勝）

Reconstruction of pGEX-4T-2-RIPXand Its Expressions inE．coli

WANGXiao-hui，WANGGui-ling
（Department of Cell Biology，The Key laboratory of Cell Biology，Ministry of Public Health of China，College of Basic Medical Sciences，China Medical University，Shenyang110001，China）

Objective To construct GST/RIPXfusion protein expression vector and induce its expression in Escherichia coli（E.coli）.MethodsThe coding sequence of RIPXwas amplified from the plasmid pcDNA3.1-RIPXby PCRand inserted into pGEX-4T-2by BamHIand Xho1.The positive recombinants were identified by restriction endonuclease digestion and DNAsequencing.Then they were transformed into E.coli BL21，induced by IPTGand identified by SDS-PAGE.ResultsEnzyme digestion and DNAsequencing results indicated that the prokaryotic expression plasmid pGEX-4T-2-RIPXwas successfully constructed and confirmed.The desired GST/RIPXfusion protein was detected by SDS-PAGE.ConclusionThe prokaryotic expression plasmid of RIPXis successfully constructed and the expression of fusion proteins is confirmed.This study provides the basis for the further purification of RIPXand research on the biological function of RIPX.

plasmid；prokaryotic expression；fusion protein；RIPX

Q257

A

0258-4646（2010）12-0987-03

國家自然科學基金資助項目（30871294）

王孝會（1987-），男，碩士.

王桂玲，E-mail：wanggl@mail.cmu.edu.cn

2010-09-28