了哥王中芫花素的提取分離與含量測定

劉麗霞， 趙 挺， 陳 揚， 孫立新*

(1.沈陽藥科大學藥學院，遼寧沈陽110016;2.遼寧省藥物研究院，遼寧沈陽110016)

了哥王是瑞香科蕘花屬植物Wikstroemia indica(L.)C.A.Mey的根莖，其性苦味寒、微辛、有毒，具有消腫止痛、清熱解毒、化痰散結等作用，臨床應用于肺熱咳喘、咽喉腫痛、跌打損傷等，療效較好，對肝炎、肝硬化、腎炎等有一定作用［1］，陳揚［2］等進行藥理研究證實了哥王具顯著抗腫瘤活性。了哥王藥材化學成分復雜，文獻報道主要為香豆素類、黃酮類、木脂素類、皂苷等，其中黃酮類成分有抗菌、抗炎、鎮痛等作用［3-4］。芫花素為黃酮類化合物，目前有關了哥王藥材中芫花素的含量測定未見報道，本實驗從藥材中分離得到芫花素并采用高效液相色譜法對其進行含量測定，為了哥王藥材質量標準的建立提供依據。

1 儀器與材料

依利特高效液相色譜儀(大連依利特分析儀器有限公司)，UV2000Ⅱ紫外可變波長檢測器(大連依利特分析儀器有限公司)，N3000色譜工作站，QE100藥材粉碎機(浙江省武義縣屹立工具有限公司)，KQ-100型超聲儀(昆山市超聲波儀器有限公司)，TG332A分析天平(湘儀天平儀器廠)。

對照品:芫花素(本實驗室自制，HPLC法測得純度質量分數大于99.0%)，甲醇、乙腈(色譜純，山東禹王實業有限公司禹城化工廠)，水(娃哈哈飲用純凈水)，其余試劑(分析純，市售)。

了哥王藥材9批，均為市售品，由沈陽藥科大學孫啟時教授鑒定為瑞香科蕘花屬植物了哥王［Wikstroemia indica(L.)C.A.Mey.］。

2 方法與結果

2.1 芫花素的分離與鑒定

了哥王藥材，粉碎，加入10倍量95%乙醇，回流提取3次，1.5 h/次，合并提取液并濃縮，回收溶劑，所得浸膏用適量水分散，依次用等量石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，回收溶劑得相應萃取物浸膏。將了哥王乙酸乙酯萃取物(146 g)干浸膏與約2倍量的硅膠拌樣，上樣于硅膠柱，氯仿-甲醇(100∶0～0∶100)梯度洗脫，共合并收集16個流分。將流分2再經硅膠柱層析，環己烷-丙酮(100∶0～0∶100)梯度洗脫，在環己烷-丙酮(20∶1)洗脫液中有黃色結晶析出，收集結晶，再經重結晶，干燥，即得芫花素(25 mg)。

樣品的1H-NMR譜數據如下1H-NMR(300 MHz，DMSO-d6)δ:3.84(3 H，s，-OCH3)，6.34(1 H，d，J=2.0 Hz，H-6)，6.72(1 H，d，J=2.0 Hz ，H-8)，6.80(1 H，s，H-3)，6.93(2 H，d，J=8.8 Hz，H-3′，5′)，7.94(2 H，d，J=8.8 Hz，H-2′，6′)，10.34(1 H，s，4′-OH)，12.93(1 H，s，5-OH);13C-NMR(75 MHz，DMSO-d6)δ:181.7(C-4)，165.0(C-7)，163.8(C-2)，161.0(C-9)，159.8(C-4′)，157.0(C-5)，128.3(C-2′，6′)，121.0(C-1′)，115.7(C-3′，5′)，109.5(C-5)，104.4(C-10)，103.0(C-3)，97.9(C-6)，92.6(C-8)，56.0(-OCH3)。該化合物光譜數據與文獻［5］報道的芫花素光譜數據基本一致，故鑒定該化合物為芫花素(genkwanin)，化學結構如圖1所示。

圖1 芫花素結構式

2.2 HPLC法測定芫花素的含量

2.2.1 色譜條件

色譜柱:依利特-C18柱 (200 mm ×4.6 mm，5 μm);流動相為甲醇-水-冰乙酸(65 ∶35 ∶2，v/v);檢測波長:332 nm;柱溫:40 ℃;流速:1.0 mL/min;進樣量:20 μL。

2.2.2 對照溶液的制備

精密稱取芫花素對照品約5 mg，置于25 mL量瓶中，用甲醇溶解，并稀釋至刻度，即得200.0 μg/mL的芫花素對照品貯備液。

2.2.3 供試溶液的制備

取了哥王干燥藥材細粉(過60目篩)約3 g，精密稱定。加90%乙醇90 mL浸泡12 h后，超聲提取3次，每次0.5 h。過濾，合并濾液，減壓蒸干，所得浸膏用甲醇溶解并定容于10 mL量瓶中，搖勻，經0.45 μm微孔濾膜得續濾液，即為供試溶液。

2.2.4 色譜系統適用性試驗

在2.2.1項色譜條件下，理論板數按芫花素計，不低于6 000。芫花素與相鄰組分峰的分離度及其拖尾因子均符合要求。色譜圖見圖2。

2.2.5 線性關系考察

精密量取芫花素對照品貯備液 0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、4.0 mL至25 mL量瓶中定容，制成芫花素系列對照溶液，質量濃度分別為0.8、1.6、4.0、8.0、16.0、32.0 μg/mL。上述系列溶液各進樣20 μL，以對照溶液的質量濃度(C，μg/mL)為橫坐標，峰面積(A)為縱坐標，繪制標準曲線，芫花素A=1.480×104C-4.012×103，相關系數r=0.999 8。結果表明芫花素質量濃度在0.8～32 μg/mL內與峰面積的線性關系良好。

2.2.6 精密度試驗

精密吸取芫花素(8.0 μg/mL)對照溶液 20 μL，按上述色譜條件連續進樣6次，記錄色譜峰面積，計算芫花素峰面積的RSD為2.2%，表明儀器精密度良好。

圖2 了哥王藥材HPLC圖譜

2.2.7 穩定性試驗

取供試品溶液(NO.4)，室溫放置，分別于 0、2、4、8、12、16、24 h進樣20 μL，記錄色譜峰面積。計算芫花素峰面積的RSD為4.1%。結果表明供試品溶液在室溫下24 h內較穩定。

2.2.8 重復性試驗

稱取同一了哥王干燥藥材細粉(NO.6)約3 g，精密稱定，按供試溶液制備方法，平行制備6份供試溶液，進樣20 μL，根據芫花素色譜峰面積，計算芫花素含量的平均值為28.37 μg/g，RSD為3.4%。結果表明方法的重復性良好。

2.2.9 回收率試驗

精密稱取已知含量的了哥王干燥藥材細粉(NO.4)約1.5 g(芫花素含量為28.37μg/g)，共9份，分別加入低、中、高3個質量濃度的對照品溶液(分別相當于藥材原有含量的50%、100%、150%)，每濃度3份，按供試溶液制備方法制備供試液，分別測定，計算含量，芫花素的平均回收率為99.8%，RSD為2.1%(n=9)，結果見表1。

表1 回收率試驗結果

2.2.10 樣品測定

精密稱取9個產地的了哥王干燥藥材細粉3.0 g，按供試溶液制備方法制備供試溶液，進樣分析后，計算芫花素的含量，結果見表2。

3 討論

3.1 HPLC分離分析條件的選擇 比較甲醇-水-冰醋酸、乙腈-水-冰醋酸洗脫系統作為流動相，二者對色譜峰的分離無明顯差異，故選擇經濟的甲醇系統，比較了磷酸、冰醋酸等酸改性劑，都抑制了峰形的拖尾現象，但冰醋酸的改善峰形的效果較好。調整流動相比例，選用甲醇-水-冰醋酸(65∶35∶2，v/v)時，樣品中待測成分分離效果較好。

表2 不同產地了哥王藥材中芫花素含量(n=3)

3.2 了哥王中芫花素提取條件的優化 比較了回流提取法和超聲提取法，結果回流提取3次，每次2 h與超聲提取3次，每次0.5 h，二者提取含量接近，因此采用方便省時的超聲提取法。比較了甲醇、無水乙醇作提取溶劑，二者提取率相近，故選用毒性小的無水乙醇，又比較了體積分數為50%、70%、90%乙醇，選擇提取率高的90%乙醇。

3.3 實驗結果表明，不同產地了哥王中芫花素含量差別明顯，其中江西和廣東產地的了哥王中芫花素含量較高，而貴州、廣西和桂林產地的偏低，可能與藥材產地的地理環境差異有關，東南地區的產量較高，西南地區產量偏低。

［1］朱亞敏，胡敏燦.了哥王的藥理研究和臨床應用［J］.浙江中醫雜志，2004，(1):42-43.

［2］陳 揚，李艷春，馬恩龍，等.了哥王抗腫瘤活性部位篩選［J］.中華中醫藥學刊，2008，26(11):2520-2521.

［3］謝宗萬主編.全國中草藥匯編(上冊)［M］.第2版.北京:人民衛生出版社，1996.

［4］羅獻瑞主編.實用中草藥彩色圖集［M］.第2版.廣州:廣東科技出版社，2000.

［5］耿立冬，張 村，肖永慶.了哥王中的1個新雙香豆素［J］.中國中藥雜志，2006，31(1):43-44.