田口實驗設計法優選黃芪皂苷的提取工藝

趙強強， 韓 麗*， 謝興亮， 吳品江， 熊永愛， 楊 明，3*

(1.成都中醫藥大學，中藥材標準化教育部重點實驗室，四川 成都 611137;2.成都醫學院，四川 成都610083;3.江西中醫學院，現代中藥制劑教育部重點實驗室，江西南昌330004)

黃芪為豆科植物蒙古黃芪Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.vat.mongholicus(Bge.)Hsiao或膜莢黃芪Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.的干燥根。黃芪味甘性溫，歸肺、脾經。具有補氣固表、利尿托毒、排膿、斂瘡生肌等功效［1］。黃芪含皂苷、黃酮、多糖及氨基酸等多種化學成分，其中皂苷為黃芪的主要活性成分，并以黃芪甲苷為主［2-3］。黃芪甲苷也是目前黃芪藥材以及制劑質量控制的常用指標性成分［4］。本實驗采用田口實驗設計法，以黃芪甲苷提取量為本研究的控制指標，考察提取各因素對提取效率的影響，優化黃芪的提取工藝條件，為工業生產提供實驗依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器 島津高效液相色譜儀，蒸發光散射檢測器(ELSD100)(美國softa公司生產)，空氣壓縮機(天津市琛航科技儀器有限公司);LC-10Atvp泵;CTO-10Asvp柱溫箱;N2000色譜工作站;StartoriousBP211D電子天平;SZ-93自動雙重純水蒸餾器(上海亞榮生化儀器廠)。

1.2 材料 黃芪甲苷對照品(批號110781-200613，供含量測定用，中國藥品生物制品檢定所提供)。試劑:乙腈為色譜純，其余試劑為分析純。水為重蒸水。本實驗所用黃芪購自四川利民中藥飲片有限責任公司，經成都中醫藥大學藥學院中藥鑒定教研室裴瑾副教授鑒定，為膜莢黃芪Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.的干燥根，按《中華人民共和國藥典》(2005年版)標準鑒定，使用藥材符合黃芪藥材質量規定。

2 方法與結果

2.1 黃芪甲苷的含量測定

2.1.1 色譜條件 色譜柱:Welc C18(250 mm×4.6 mm，5 μm);流動相:乙腈-水(40∶60);流速:1 mL/min;柱溫:30℃;ELSD檢測器條件:漂移管溫度為80℃，載氣(空氣)流量為50psi。理論塔板數以黃芪甲苷峰計算應不低于4 000。

2.1.2 線性關系考察 精密稱取黃芪甲苷對照品5.10 mg，加甲醇定容至10 mL量瓶中，搖勻即得。取對照品溶液，分別進樣 8、10、12、16、20、22 μL，以進樣量的對數(μg)為橫坐標、峰面積的對數為縱坐標繪制標準曲線，得回歸方程為y=1.419 8x+5.347 7，r=0.999 3黃芪甲苷在4.08～11.22 μg范圍內呈良好線性。

2.1.3 精密度試驗 精密吸取黃芪甲苷對照品溶液10 μL，連續進樣6次，記錄黃芪甲苷峰面積，結果 RSD為1.26%。

2.1.4 穩定性試驗 將同一份供試品溶液于室溫下放置，分別于第 0、2、4、6、8 h 各進樣 10 μL，按上述色譜條件檢測，記錄黃芪甲苷峰面積值，其RSD為2.18%，表明供試品溶液在室溫下放置8 h內穩定。

2.1.5 重復性試驗 取同一樣品溶液5份，按上述供試品溶液制備方法制備，按照上述色譜條件分別進行測定，記錄黃芪甲苷峰面積值，RSD為2.08%。

2.1.6 加樣回收率試驗 取已知含量的樣品溶液(0.113 3 mg/mL)6份，分別精密加入濃度為1.03 mg/mL的黃芪甲苷對照品溶液1.3 mL，按上述供試品溶液制備方法制備，按照上述色譜條件分別進行測定，計算平均回收率為101.62%，RSD為1.88%。結果見表1。

表1 加樣回收率試驗測定結果

2.1.7 樣品測定 將黃芪飲片在50℃烘干，精密稱取各約100 g的藥材9份，按表2中的條件進行加熱回流提取。分別取適量提取液水浴揮干，殘渣加10 mL水溶解，用水飽和的正丁醇萃取4次，每次40 mL，合并正丁醇萃取液，用氨試液萃取2次，每次40 mL，棄去，正丁醇液蒸干，殘渣用甲醇溶解并轉移至5 mL量瓶內，加甲醇至刻度，搖勻，作為供試品溶液。分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，用外標法計算，色譜圖見圖1、2。

圖1 黃芪甲苷對照品色譜圖

圖2 供試品色譜圖

2.2 提取工藝因素水平的確定

根據文獻報道及預試驗結果，選擇乙醇提取，影響乙醇提取的主要因素有乙醇濃度及用量、提取時間及次數，選用L9(3)4正交設計表進行實驗。以黃芪甲苷的提取量為評價指標，進行最佳提取工藝的篩選。正交設計表表頭設計見表2。

表2 試驗因素水平

2.3 結果與分析

2.3.1 實驗結果 稱取黃芪飲片100 g 9份，按表2中條件進行加熱回流提取。分別測定黃芪甲苷的提取量，結果見表3。

2.3.2 田口設計 Taguchi方法根據對試驗中質量特性值要求的數值范圍不同，分為望目值、望大值和望小值質量特性，其中望大值質量特性是希望質量特性值越大越好，波動的程度越小越好。而在試驗中，影響質量特性波動的原因為因素，主要分為可控因素和不可控因素。可控因素主要是能夠在試驗中人為加以控制的因素，如乙醇濃度及用量、提取時間及次數等;不可控因素主要是在試驗中事先設定或較難控制的因素，如標示因素、誤差因素等。本實驗主要關注可控影響因素對黃芪甲苷提取量的影響。

Taguchi方法能夠充分利用系統中存在的非線性效應，通過選取適當的正交設計表安排試驗，然后通過對試驗結果進行信噪比分析和方差分析確定各因素的最優條件以及影響顯著性程度。本實驗選用L9(3)4正交設計表進行實驗，結果見表3，在表3中，S/N為信噪比值，信噪比計算公式如下:

公式中，yi為黃芪甲苷提取量，yexp為預測黃芪甲苷提取量，本實驗取望大值，即S/N數值越大越好。

表3 田口實驗數據計算

由于Taguchi方法中，S/N值最大的水平為最優水平，因此通過算術平均方法求出各個因素在不同水平上的平均S/N值，并以圖的形式給出了各因素隨不同水平的變化趨勢(見圖3)。由圖3可知，A因素(乙醇濃度)的3號水平，B因素(乙醇用量)的3號水平，C因素(提取時間)的3號水平，D因素(提取次數)的3號水平為各因素的最佳水平。

圖3 各因素在不同水平的S/N變化趨勢圖

通過S/N值方差分析考察了各因素對黃芪甲苷提取量影響的顯著性，方法分析結果見表4，F值是各因素影響顯著性的重要指標，F值越大，說明該因素影響越顯著，此外，純平方和在總平方和中所占的比率稱為貢獻率，也可用來估計各因素的影響顯著性程度。由表4可見，因素D提取次數影響最顯著，因素A乙醇濃度、B乙醇用量、和C提取時間影響較小，即黃芪甲苷的提取量受提取次數影響遠大于其他因素。

表4 方差分析

通過平均S/N值，結合方差分析結果，考慮到工業生產成本及安全性等問題，故選A、B、C三因素的1號水平，D因素的3號水平。采用design expert7.1軟件A1B1C1D3預測了各因素在上述最優水平條件下信噪比值S/N為-1.794 4，將此值帶入S/N計算公式，可以得出黃芪甲苷提取量的最佳預測值為0.81 mg/g。

2.4 驗證實驗

由于所選方案是正交表中沒有的方案，故尚需做實驗予以驗證。取與上述正交實驗同批次的黃芪飲片250 g，共3份，按方案A1B1C1D3進行提取，其余操作同前，結果見表5，與預測結果比較，差別不大，結果較為滿意。

表5 驗證試驗結果

3 討論

3.1 田口試驗設計是利用正交表挑選試驗條件、安排試驗的方法。其設計過程分3個階段，即:系統設計、參數設計和容差設計。其中重點是參數設計，而參數設計的重點是穩定性設計。常采用信噪比(S/N)作為衡量穩定性好壞的指標。

該試驗設計方法的優點是成功地運用以信噪比作為質量評價指標，以尋求最優的穩定性好的參數組合［5］，并能實驗最佳組合進行預測。

3.2 由于黃芪甲苷僅在200 nm左右有微弱的末端吸收，采用紫外檢測器進行檢測干擾大，靈敏度低，而蒸發光散射檢測器(ELSD)對無紫外吸收的化合物具有較高的檢測靈敏度，因此選用HPLC-ELSD對黃芪甲苷進行含量測定。

［1］中國藥典［S］.一部.2005:212.

［2］Xiao Hongbin，Liang Xinmiao，Lu Peichang.Total analytical method for Radix astragali extract usingtwo-binarymulti-segment gradient elution liquid chromatography［J］.J Separa Sci，2001，24(3):186-196.

［3］Xiao H B，Krucker M，Putzbach K，et al.Capillary liquid chromatography-microcoil H-1 nuclear magnetic resonance spectroscopy and liquid chromatography-ion trap mass spectrometry for on-line structure elucidation of isoflavones in Radix astragali［J］.J Chromatogr，2002(1):135-143.

［4］夏廣萍，劉 鵬，韓英梅.不同處理方法和不同產地黃芪藥材中黃芪甲苷的含量測定［J］.中藥材，2008，31(3):386.

［5］施月芹，練富林，胡育筑.田口方法及其在藥學相關領域的應用［J］.藥學進展，2008，32(8):363.