HPLC法測定黃連及炮制品中4種生物堿的含量

劉 峰， 張振秋， 賴靜怡， 胡 北

(遼寧中醫藥大學藥學院，遼寧大連116600)

黃連為毛茛科植物黃連(Coptis chinensis Franch.)、三角葉黃連(Coptis deltoidea C.Y.Cheng et Hsiao)或云連(Coptis teeta Wall.)的干燥根莖，主要分布于我國四川、云南、湖北等地。其味苦，性寒。歸心、脾、胃、肝、膽、大腸經。具有清熱燥濕，瀉火解毒功效［1］。黃連藥材所含的生物堿主要有小檗堿(berberine)、巴馬汀(pamatine)、黃連堿(coptisine)、藥根堿(jatrorrhizine)等小檗堿型生物堿［2-3］，本實驗采用HPLC法對10個不同來源黃連藥材及8種不同炮制品樣品進行分析，旨在對黃連生品和炮制品進行質量控制。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1100型高效液相色譜儀，配置四元梯度泵、在線脫氣機、VWD檢測器;AS3120A超聲提取器;2140型電子分析天平、METTLER AB135-S十萬分之一電子天平(瑞士);U-3010型紫外-可見分光光度計、HH-4數顯恒溫水浴鍋。

1.2 試藥

鹽酸黃連堿對照品、鹽酸巴馬汀對照品由上海順勃生物工程技術有限公司提供，鹽酸藥根堿對照品(批號:110733-200806)、鹽酸小檗堿對照品(批號:110713-200804)均購于中國藥品生物制品檢定所。本研究收集了10種不同來源的黃連藥材(見表1)，經遼寧中醫藥大學李峰教授鑒定均為正品藥材。黃連炮制品均由四川購進的同一批黃連藥材(8號)，參照《中國藥典》、《中藥炮制學》、《中藥炮制學辭典》中黃連的不同炮制方法依法自制［1，4-5］，分別得到酒制、醋制、萸制、鹽制、姜制、膽制、土制和碳制等不同黃連炮制品。乙腈、甲醇為色譜純，水為重蒸餾水。其它試劑均為分析純。

表1 樣品的來源及收集時間

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱:Phenomoil-C18BDS(250 mm×4.6 mm，5 μm);流動相:乙腈-水(45 ∶55，內含磷酸二氫鉀0.34 g，十二烷基硫酸鈉0.17 g);檢測波長:345 nm;流速:1.0 mL/min;柱溫:25 ℃;進樣量:10 μL。

2.2 對照品溶液的制備

分別精密稱取鹽酸小檗堿，鹽酸巴馬汀，鹽酸黃連堿，鹽酸藥根堿對照品適量，加甲醇-鹽酸(100∶1)溶解，制成濃度分別為0.160 0 mg/mL、0.202 0 mg/mL、0.153 6 mg/mL、0.244 4 mg/mL 的對照品貯備液，備用。精密吸取鹽酸小檗堿對照品貯備液7.3 mL，鹽酸巴馬汀對照品貯備液1.1 mL，鹽酸黃連堿對照品貯備液0.9 mL，鹽酸藥根堿對照品貯備液0.6 mL，置同一棕色10 mL量瓶中，加甲醇-鹽酸(100∶1)稀釋至刻度，搖勻，制得混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

精密稱取不同來源及不同炮制品黃連藥材(過20目篩)0.1 g至具塞錐形瓶中，加入甲醇—鹽酸(100 ∶1)100 mL，稱重，超聲 1 h，取出放至室溫，用甲醇-鹽酸(100∶1)補足損失的重量，濾過取續濾液，作為供試品溶液，備用。

2.4 系統適用性試驗

精密吸取混合對照品溶液、供試品溶液，注入HPLC色譜儀，記錄色譜圖，在選定的色譜條件下鹽酸小檗堿，鹽酸巴馬汀，鹽酸黃連堿和鹽酸藥根堿的理論塔板數均不少于10 000，與其他峰的分離度均大于1.5。見圖1。

圖1 混合對照品(A)和樣品(B)HPLC譜圖

2.5 方法學考察

2.5.1 標準曲線的制備 精密吸取2.2項下的混合對照品溶液 2、4、6、8、10 μL 注入高效液相色譜儀，測定。以進樣量為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，計算回歸方程，結果見表2。

表2 標準曲線結果表

2.5.2 精密度試驗 精密吸取同一供試品溶液(8號藥材)連續進樣6次，記錄色譜峰面積，結果鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸黃連堿和鹽酸藥根堿峰面積的RSD值分別為1.3%、1.2%、1.4%、1.8%。結果表明，儀器精密度較好。

2.5.3 穩定性試驗 精密吸取同一供試品溶液(8號藥材)在0、2、4、8、10、12 h 分別進樣分析，記錄色譜峰面積，結果鹽酸小檗堿，鹽酸巴馬汀、鹽酸黃連堿和鹽酸藥根堿峰面積的RSD值分別為2.3%、2.4%、2.5%和2.1%。結果表明，供試品在本實驗條件下穩定性良好。

2.5.4 重復性試驗 取黃連藥材(8號藥材)5份，每份約0.1 g，按2.3項方法制備，并進樣分析，記錄色譜峰面積，結果鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸黃連堿和鹽酸藥根堿峰面積的RSD值分別為2.1%、2.6%、2.8%和1.9%。結果表明，本方法重復性較好。

2.5.5 加樣回收率試驗 取已知鹽酸小檗堿(45.40 mg/g)、鹽酸巴馬汀(13.86 mg/g)、鹽酸黃連堿(20.71 mg/g)和鹽酸藥根堿(4.53 mg/g)含量的藥材(8號藥材)5份，每份約0.05 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入鹽酸小檗堿對照品貯備液14.19 mL(0.160 0 mg/mL)、鹽酸巴馬汀對照品3.43 mL(0.202 0 mg/mL)、鹽酸黃連堿對照品6.74 mL(0.153 6 mg/mL)、鹽酸藥根堿對照品0.93 mL(0.244 4 mg/mL)于具塞錐形瓶中，按2.3項下方法制備供試品溶液并進樣分析，結果鹽酸小檗堿的平均回收率為100.5%，RSD為2.5%;鹽酸巴馬汀的平均回收率為100.7%，RSD為2.7%;鹽酸黃連堿的平均回收率為100.7%，RSD為2.7%;鹽酸藥根堿的平均回收率為102.6%，RSD為2.4%。

2.6 不同來源黃連藥材及不同炮制品的含量測定

分別取不同來源黃連藥材及不同炮制品，按2.3項下方法制備，精密吸取供試品溶液10 μL、對照品溶液5 μL、10 μL注入高效液相色譜儀，按2.1項下色譜條件測定，采用外標二點法計算鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸黃連堿和鹽酸藥根堿的含量，結果見表3、4。

3 討論

3.1 從表3可以看出10個不同來源的黃連藥材(味連)四種指標性成分含量差別較大，鹽酸小檗堿的含量從45.40～29.84 mg/g;鹽酸黃連堿的含量從20.71～10.29 mg/g;鹽酸巴馬汀的含量從14.57～7.85 mg/g;鹽酸藥根堿的含量從4.95～2.55 mg/g。從生物堿的總量來看，四川的黃連藥材總含量最高，南京藥材總含量最低。

表3 不同來源黃連藥材中4種生物堿的含量測定結果表(n=3)

表4 不同炮制品及生品(8號)中4種生物堿的含量測定結果表(n=3)

3.2 本實驗首次測定了黃連8種不同炮制品的4種生物堿含量，從表4可以看出8種不同炮制品的4種指標性成分的含量有一定差異，所測定不同炮制品的生物堿含量順序為:酒制＞醋制＞姜制＞萸制＞土制＞膽制＞鹽制＞碳制，結果顯示用不同輔料炮制后，生物堿的浸出率不一樣，酒制和醋制的浸出率較高。

3.3 表4中生品(8號)與不同炮制品對比可以看出，黃連炮制前后生物堿含量有差異。結果顯示炮制對其有所影響;不同炮制品中4種生物堿的含量也有一定差異，它提示根據中醫藥理論及辯證論治法則，選用不同炮制品的黃連配伍處方入藥，為不同的制劑及臨床用藥提供了依據。

［1］中國藥典［S］.一部.2005:141.

［2］Zhou Yuanyao，Chen Yanxiang，Zhu Bin，et al.Optimization of HPLC conditions for 15 naturally occurring protobererine type quaternary alkaloids［J］.Acia Pharm Sin，1988，23(12):938.

［3］晁若冰，張 浩，莊燕黎，等.高效液相色譜法測定黃連藥材中小檗堿型生物堿的含量［J］.藥物分析雜志，2003，23(5):354-357.

［4］葉定江，張世臣，潘三紅.中藥炮制學［M］.北京:中國中醫藥出版社，1999:216.

［5］葉定江，原思通.中藥炮制學辭典［M］.上海:上海科學技術出版社，2005:6.